realtimePCR和RT-PCR详解及其区别要点.pdfVIP

real-time PCR 技术的原理及应用 摘要：一、实时荧光定量 PCR原理 （一）定义：在 PCR反应体系中 加入荧光基团， 利用荧光信号累积实时监测整个 PCR进程，最后通过 标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 。 （二）实时原理 1 、常 规 PCR技术： 对 PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法 对起始模板准 一、实时荧光定量 PCR原理 （一）定义：在 PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累 积实时监测整个 PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分 析的方法 。 （二）实时原理 1、常规 PCR技术： 对 PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板 准确定量，无法对扩增反应实时检测。 2、实时定量 PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测 PCR扩增反应中每一个循环扩增产 物量的变化，通过 Ct 值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 3、如何对起始模板定量？ 通过 Ct 值和标准曲线对起始模板进行定量分析 . 4、几个概念： （1）扩增曲线 ： （2 ） 荧光阈值： （3 ）Ct 值： CT值的重现性： 5、定量原理： n 理想的 PCR反应： X=X 0 *2 n 0 非理想的 PCR反应： X=X (1+Ex) n ：扩增反应的循环次数 X ：第 n 次循环后的产物量 X 0 ：初始模板量 Ex ：扩增效率 5、标准曲线 6、绝对定量 1）确定未知样品的 C(t) 值 2）通过标准曲线由未知样品的 C(t) 值推算出其初始量 7、DNA的荧光标记： 二、实时荧光定量 PCR的几种方法介绍 方法一： SYBR Green法 （一）工作原理 1、SYBR Green 能结合到双链 DNA的小沟部位 2 、SYBR Green 只有和双链 DNA结合后才发荧光 3、变性时， DNA双链分开，无荧光 4、复性和延伸时，形成双链 DNA， SYBRGreen 发荧光，在此阶 段采集荧光信号。 PCR反应体系的建立及优化 : 1 、SYBR Green 使用浓度 : 太高抑制 Taq 酶活性，太低，荧光信 号太弱，不易检测 2 、Primer ：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3、MgCl2的浓度 : 可以降低到 1.5mM,以减少非特异性产物 4、反应 Buffer 体系的优化 5、反应温度和时间参数 : 由酶和引物决定 6 、其他与常规 PCR相同 （二）应用范围 1、起始模板的测定； 2、 基因型的分析； 3、 融解曲线分析： 可以优化 PCR反应的条件， 对常规 PCR有指