G418筛选稳定表达细胞系经验总结.docVIP

(完好版)G418挑选稳固表达细胞系经验总结 (完好版)G418挑选稳固表达细胞系经验总结 PAGE / NUMPAGES (完好版)G418挑选稳固表达细胞系经验总结 G418挑选稳固表达细胞系经验总结 我做了稳固转染，从 G418 浓度确立到最后的单克隆化判定。有自己的领会也有其 他战友碰到的状况 , 和大家分享 . 没有总结好的地方，大家增补。 挑选从前确立 G418浓度： 1、因为每种细胞对 G418的敏感性不同，并且不同的厂家生产的 G418 有效成分的比重不同，一般 1g 的粉剂中有效的 G418含量大概为 0.722g 。 2、G418是新霉素的近似物，二者都是经过克制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细 胞的。可是新霉素对真核细胞无作用而 G418对细菌和真核细胞都起作用。 neo 就是编码 3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素 G418。在进行转染时细胞膜遇到 影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上 G418 有杀菌作用，所以有人主张转转染 时不加其余抗生素。 3、集合度对 G418挑选结果的影响很大，一般挑选时集合度不宜超出 50% 4，G418的活性不尽同样，所以在挑选从前， 必定要确立 G418的最正确挑选浓度。详细如 下：将细胞稀释到 1000 个细胞 /ml ，在 100ug/ml~1mg/ml 的 G418浓度范围内进行挑选， 选择出在 10~14 天内使细胞所有死亡的最低 G418浓度来进行下一步的挑选试验。一个 详细试验： 3x106 个细胞电转后，分别接种 1/4000 ，1/1000 ，1/300 细胞到 24 孔板中， 48h 后加药挑选，此时 1/300 细胞孔内大概 50%集合度。理论上 1/4000 孔内应有 4%的集合度。挑选 9 天后，察看 1/4000 孔内有两三个克隆，按比率 1/300 孔内应当有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。 加药时间和保持浓度 1，因为基因转染到细胞内以后要一段时间才能表达出蛋白质。所以挑选不可以太早；但 是也不可以太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被 没有外源基因转入的细胞所吞没，最后致使挑选不出阳性克隆，一般要在转染 24 小时 以后才开始加 G418挑选。跟着细胞的代谢 G418的浓度和活性都会降落，所以每 3~5 天 都要改换一次含有 G418的挑选液。这时药物浓度能够降至 200ug/ml 。 2，加抗生素的机遇，主若是考虑插入到细胞基因组的抗性基因能否已经获取表达。一 般是转染 48 小时后加入抗生素。挑出单克隆后就能够用保持浓度，一般是挑选浓度的 1/2 。 对于保持浓度，有人说细胞会出现抗衡生素的抗性，应不停提升其浓度。并且，假如你要精选到几个阳性克隆中较高表达的克隆的话，能够调整抗生素的浓度。自然，抗性基因高表达，目的基因不必定就跟着高表达。 挑选时的培育液 加药挑选约 6 天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥可数。这时会出现两个问题： 1， 死亡的细胞会裂解开释出有害物质，致使那些有 neo 表达的阳性细胞死亡，即非选 择性死亡，所以要实时换液 ，孔中细胞数目极少，细胞之间的信号会变得很弱，也会致使阳性细胞的状态不好甚 至死亡。这个时候需要一种特别的培育液：若是你要转染 3T3 细胞，在 3T3 细胞集合度达到 80%的时候，换液，培育留宿以后采集培育液，经过滤器消毒，和新鲜的培育液按 1：1 混淆备用。再转染后挑选过程中就能够应用这类培育基。 3，适合增添血清浓度。 挑选时出现的问题及其解决方法： 1，问题 1。做 hela 细胞的挑选，此刻已经挑选 3 周，在 6 孔板中已经长出一些细胞簇，想把它挑到 96 孔板中，就用 2ul 胰酶消化，在消化过程中，胰酶扩散，细胞已经四散开，和四周的其余细胞簇交融在一同（我的细胞簇离的很近） ，就是说几个细胞簇被胰酶交融在一同，那样根本没有方法做下去了，该怎么办？ a、能够减少胰酶量；胰酶在加入从前要用 37 度温箱预热，并且 PBS润洗细胞层，以减 少可能残余的血清的影响； b、加入胰酶后，稍过几秒钟就能够吸走消化液了，不用吸洁净，而后放到 37 度温箱中 连续作用 1MIN，这时，消化酶能够连续作用的，又可防止胰酶扩散； c、显微镜下察看细胞完好松懈开，就能够在你感兴趣的局部加培育基，并吸走你的可 隆了呀 d、详细消化的时间，你注意探索一下，假如在步骤 2 中显微镜下见细胞还没有完好松懈 开，能够再重复的，直到松懈开，能够被吸走为止。 我的建议： 1、在 100mm dish 中挑克隆，细胞分的稀一点。 2、把细胞所有消化下来， 在 96 孔板中逐渐稀释获取单克隆 2，问题 2。挑选成功的概率