凝胶过滤层析法分离血红蛋白.pptVIP

谢谢观赏 凝胶过滤层析法别离血红蛋白 化学生物学实验 药学院 化学生物学教研室 * 谢谢欣赏 2021-5-18 1.实验目的 初步了解凝胶过滤层析法的简单原理及应用 初步掌握应用凝胶过滤法别离蛋白质 1 2 * 谢谢欣赏 2021-5-18 2.实验原理 层析法是利用混合物中各组分物理经学性质的差异〔如吸附力、溶解度、分子形状、大小和极性等〕，使各组分以不同的程度分布在两相中，从而使各组分以不同的速度随流动相向前流动而到达别离的目的。层析法可分为多种类型，包括分配层析，离子交换层析，凝胶过滤层析，亲和层析等。 层析法 分配层析 离子交换层析 凝胶过滤层析 亲和层析 * 谢谢欣赏 2021-5-18 2.实验原理 1 待别离混合物〔A、B〕随流动相通过固定相 由于理化性质差异，与两相发生相互作用〔吸附、溶解、结合等〕的能力不同，在两相中的分配〔含量比照〕不同 与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时受到的阻滞作用小，移动速度快 分步收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而到达将各组分别离的目的 2 3 4 * 谢谢欣赏 2021-5-18 凝胶过滤层析，主要根据混合物中分子的大小及形状不同，在通过凝胶〔固定相〕时，分子的扩散速率各异而到达别离的目的。凝胶颗粒具有多孔性的网状结构，小分子可以进入凝胶颗粒内部，流程长而移动速率慢〔阻滞作用大〕；而大分子那么被排除在外，沿凝胶间空隙随〔流动相〕流动，流动短而移动速率快〔阻滞作用小〕，比小分子物质先流出层析床，所以凝胶过滤层析又称为排阻层析，分子筛层析，凝胶过滤法操作简例，且操作条件温和，不易引起生物样品变性失活，别离效果好，故广泛应用于蛋白质、酶、核酸的别离提纯〔包括脱盐、浓盐及分子量的测定等〕 2.实验原理 * * 本实验通过sephaaadexG50层析柱，以蒸馏水为流动相，别离血红蛋白〔红色，分子量约64,500〕与二硝基氟苯-鱼精蛋白〔鱼精蛋白与二硝基氟苯结合后为黄色，分子量为2,000-12,000〕的混合物，从颜色的不同即可观察到血红蛋白洗脱较快，鱼精蛋白洗脱较慢。 2.实验原理 * 谢谢欣赏 2021-5-18 3.实验用品 试剂 〔1〕交联葡聚糖G-50 〔2〕二硝基氟苯 〔3〕鱼精蛋白 〔4〕0.9%NaaaCl 〔5〕10%碳酸氢钠 〔6〕95%乙醇 仪器 〔1〕锥形瓶 〔2〕层析柱〔1cm×25cm的玻璃柱〕〔3〕铁架台 〔4〕弹簧夹 〔5〕细橡皮管〔长2cm〕〔6〕量筒 〔7〕小烧杯100ml * * 4.操作步骤 1、凝胶准备：取sephaaadex G-50 3g置于锥形瓶中，加蒸馏水90ml，于沸水浴中煮沸2小时(或放于水中浸泡6小时)，充分膨胀凝胶。取出，冷却至室温后备用。 2、装柱：关闭下口，向玻璃柱内参加蒸馏水达柱总长度约1/3处，把膨胀好的糊状凝胶边搅拌、边自柱的顶端沿管内壁缓缓参加柱中至柱顶部，待柱底部凝胶沉积至1-2cm时，开启柱底部出水口，并控制一定的流速，使柱中的凝胶一直处在溶液中。再慢慢地继续参加凝胶，直至凝胶体积至柱顶2.5cm左右，最好一次连续装完，假设分次装入，需用玻璃棒轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面。装柱长度至少8cm。最后放入略小于层析柱内径的圆形小滤纸片，以防将来加样时凝胶被冲起。 * * 4.操作步骤 3、平衡：用10ml左右的蒸馏水流洗整个柱床。操作过程中严防出现气泡和分层，如床面不平，可用玻璃棒轻轻搅动外表，是凝胶重新自然沉降。整个过程中勿使液面低于床面，以免气体进入，使柱床干裂。 4、加样：待柱床面以下的蒸馏水流出，且刚好与床面相切时(切不可使床面完全暴露于空气中)，关闭下口。用滴管取血红蛋白及鱼精蛋白混合液〔血红蛋白稀释液3滴加DNP-鱼精蛋白溶液3滴〕，十分小心地并缓缓沿内壁参加(注意切勿破坏柱床面)，翻开柱底部出口，使样品进入床内，至床面重新露出时，先参加少量的蒸馏水，冲洗床面1-2次，然后再参加足量蒸馏水。 * * 谢谢观赏