第四讲　细胞冻存、复苏与细胞系(株)的建立.pptVIP

动物细胞培养技术 主讲教师：王海东 2014.9 本章重点 了解并能掌握细胞冻存与复苏的方法。 冷冻与复苏的基本原则：慢冻快融。 一、培养物的冷冻与复苏原理 冷冻保存：就是将体外培养物悬浮在加有或不加有冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（低于-70℃的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。 复苏：就是以一定的复温速率将冷冻的培养物恢复到常温的过程。 冰晶损伤：因水结冰形成冰晶而致细胞损伤被称为细胞内的冰晶损伤。 溶液损伤：因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶质损伤。 在溶液中加入冷冻保护剂可保护细胞免受这两种损伤。例，DMSO、甘油。 不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样，且还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。 1.冷冻速率 指降温的速度，直接关系到冷冻效果。 过快形成较大的冰晶 过慢造成细胞严重脱水 目前多采用“二步冻结法”即先对细胞慢速冷却至一定温度，如-20℃或-30℃，使细胞外冻结，胞内脱水，然后再快速降温。 2.冷冻保存温度 最佳保存温度（液氮）-196℃，此时细胞生命活动几乎停止。 10年以上 -70℃ - -80℃冷冻细胞，短期内对细胞活性无明显影响。1个月 -40℃以内对细胞保存不佳 -10℃ - -20℃存活率为零 3.复温或融化速度 融化温度不当会降低冻存细胞存活率。一般来说复苏温度越快越好。常规做法：取出，在37℃水浴中1-2min内完成复苏。 二、冷冻保存的方法 按照冷冻保护液在冻存后是否形成冰晶来划分，冻存方法分为非玻璃化和玻璃化冻存两种。 非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70℃ - -80℃，然后直接投入液氮进行保存，或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气液，按一定的降温速率从室温降至-100℃以下，再直接投入液氮进行保存的方法。或多或少有冰晶形成 玻璃化冻存是指利用多种高浓度保护剂组合成的玻璃化冷冻保护液悬浮细胞，直接投入液氮进行保存的方法。 无冰晶形成。 1.非玻璃化冻存 ⑴将处于对数生长期的培养物消化，制单细胞悬液，计数。 ⑵1000r/min,5min,去上清。 ⑶加入冷冻液，轻轻吹散。 ⑷分装，1-1.5ml，标记名称、日期等。 ⑸分级冷冻，多种方法： 第一种：4℃,40min——-20℃,30-60min——-30℃, 30min——-80℃,过夜——投入液氮。 第二种：先挂在液氮罐口20min，再直接投入液氮中 保存。 第三种：放入电子计算机程控降温仪内，并据不同细胞以不同降温速度连续降温至-100 ℃以下，再投入液氮保存。 （6）作好冷冻记录，冻存日期，细胞代号，冻存管数，冻存过程中降温的情况，冻存位置和经手人等。 注意事项 ⑴DMSO不高压灭菌且有毒,不用滤膜过滤。 ⑵-30℃在分级降温时可省。 ⑶0℃ - -60℃这一范围为“危险温区”时间不宜过长。 ⑷塑料管冻存。 ⑸容积不能超过1/2。 2.玻璃化冻存方法 ⑴将冷冻离心管先预冷 ⑵离心细胞悬液，弃上清，1000r/min. ⑶滴加冷冻液至细胞为1×106-1.5×106个/ml，滴加速度要控制好，约0.5ml。 ⑷吹散细胞悬液。 ⑸分装，12ml冷冻小管装0.8ml悬液。 ⑹两端火焰灭菌。 ⑺投入液氮保存。600℃/min 3.短期保存 ⑴细胞悬液 4℃，定期换液，1周 ⑵单层细胞保存法 25℃-30℃，定期换液，1个月 三、复苏 1.非玻璃化冻存细胞复苏方法 ⑴液氮取出投入37℃-38℃水浴中，1-2min复温; ⑵加入5ml血清培养液，一般为原体积的4倍; ⑶离心弃上清; ⑷加培养液吹散，培养。 2.玻璃化冻存方法 ⑴取出冰浴5min; ⑵剪断管两端，将5ml细胞悬液移至50ml离心管中; ⑶冰浴中，加入预冷的血清HanksBSS液，速度0.5ml/min，65min内加完; ⑷400r/min,5min离心，弃上清，加足培养液，吹散，培养。 四、运输 液氮罐，暖水瓶，保温饭盒等。 一、基本概念 细胞系 细胞株 二、建立细胞系（株）的档案 建立细胞系或细胞株应对如下几方面加以说明： 1.培养细胞的来源 对拟建立的细胞系（株）应交代细胞供体所属物种及供体的年龄、性别、取材的器官或组织。如是肿瘤组织、应说明临床诊断结果、组织来源和病例号等。 2.细胞生物学特征 对所培养细胞的生物学性状予以说明。 三、细胞系的鉴定 拟建立的细胞系或细胞株、除说明培养细胞的来源外，还要对其进行一系列的鉴定。 2.细胞系的稳定性 细胞连续培养过程中