基因工程实验.pdf

——凯 1.简述本学期从基因组 DNA 提取到重组质粒鉴定的实验流程（ 实验题目的总结 ） 答：①基因组 DNA 的提取；② PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化 PCR扩增的 DNA 片 段以及 DNA 的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组 质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器 （自己写的） 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一 档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器； ⑥弃掉枪头；⑦ 将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时， DNA 通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么 答： loading Buffer 。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作 1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。 （题目有歧义 ） 答：①取琼脂粉置于锥形瓶，量取 50ml 1 ×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂溶解；②将 移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至 55℃下后，缓慢 导入该胶室里；③量取合适量 1 ×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线；④等凝 胶凝固后， 将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置； ⑦打开电泳仪的 开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经 BE 染色放入 成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中 DNA 分子迁移率受哪些因素的影响（实验书 P75） 答：①样品 DNA 的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入 染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行 DNA 抽提时应注意什么（实验书 P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组 DNA 提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用 答：酚——是蛋白质变性，抑制 DNA 酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相 与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取 DNA 实验中，通常可选用哪些试剂沉淀 DNA 答：冷的无水乙醇，冷的异丙醇，终浓度为～ L 的 NaCl 9.简述在 DNA 提取实验中个试剂的作用（ SDS，EDTA，酚/ 氯仿 / 异戊醇、无水乙醇， 70%乙 醇）。 答： SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白； EDTA——整合金属离子，抑制 DNase 活性；酚 / 氯 仿/ 异戊醇——见第 7 题；无水乙醇——沉淀 DNA；70%乙醇——洗涤 DNA 沉淀。 10.简述 PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用 （Mg2+ ，dNTP，引物，DNA，缓冲液， Taq DNA 聚合酶）。 答 :(1)利用半保留复制的原理，以待扩增的 DNA 为模板，通过一系列酶在体外引物介导下， 经高温变性，低温退火，适温延伸三个步骤合成特异 DNA 片段。 （2 ）Mg2+ ：TaqDNA 聚合酶的活性需要； dNTP：作为底物； 引物：作为延伸的出发点； DNA： 模板；缓冲液：维持反应环境的 PH 值； TaqDNA 聚合酶：催化 DNA 的合成。 11.PCR循环次数是否越多越好，为什么 答：否。因为