[精选]血清清蛋白、γ球蛋白的分离、提纯与鉴定实验报告资料.docxVIP

南方医科丈修 生物化学实验报告 姓名: 专业年级：组别: 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 仃 itle of Experimetn) 血清清蛋白、Y? 球蛋白的分离、提纯与鉴定 实验日期 (Date of Experiment) 2013-12-11 实验地点 （Lab No.） 合作者 (Partner) 指导老师 (Instructor) 总分 (Total Score) 教师签名 (Signature) 批改日期 （Date） 【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、 主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）： XX 实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、 掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、 掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 实验原理：1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 2、 不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化 各种蛋白质。 3、 盐析法：盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可 使蛋白质在 水中溶解度降低，从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲 和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。中性盐加入蛋白质溶液后 由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋 白质分子之间聚集而沉淀。 4、 离子交换层析：离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利 用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 5、 醋酸纤维素薄膜电泳原理：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于PH7.4它们在 PH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大 小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电 泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin）、a 1 ■球蛋白、a ，球蛋白、B ■球蛋白、丫 ■球蛋白5条区带。 实验材料 人混合血清 葡聚糖凝胶（G?25）层析柱 DEAE千维离子交换层析柱 饱和硫酸鞍溶液 醋酸鞍缓冲溶液 20% 磺基水杨酸 1 %BaQ溶液 氨基黑染色液 漂洗液PH8.6 巴比妥缓冲溶液 电泳仪、电泳槽 实验流程盐析（粗分离）一葡聚糖凝胶层析（脱盐）一DEAE千维素离子交换层析（纯化）一 实验流程 醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定） 实验步骤: 盐析+凝胶柱层析除盐: 取血清0.8ml ，边摇边缓慢滴加饱和硫酸鞍溶液 0.8ml、混匀室温放置 10min, 4000r/min 离心 10min （二）离子交换层析（纯化） 除盐后收集的球蛋口 过DEAE纤维索层析柱（1.0 x 6cm） （三）醋酸纤维素薄膜电泳: 1、点样（如下 图） 卡欣 卡欣 一?点样区 （粗面） 2cm 1.5cm 点样线尽量点得细窄而均匀，宁少勿多 2、电泳： 薄膜粗面向下 点样端置阴极端 两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平 电压:110V 时间:50min 3、染色和漂洗： 电泳完毕后，矢闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中 5mi n。 取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗液中浸洗脱色（一般更换 2次），至背景 颜色脱净为止。 取出膜，用滤纸吸干即可。 注意事项： 1、 所用血清应新鲜，无沉淀物及细菌滋生。 2、 使用时勿将各时段所应用的溶液浓度弄错。 3、 上样时，滴管应沿柱上端内壁加入样品，动作应轻、慢，勿将柱床冲起。流洗平衡时亦 应如此。 4、 洗脱时应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，并注意层析柱不要流干，进入空气。 5、切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查SQ，的BaCb混淆，因二者与相应物质生成的沉淀均为 白色。 6葡聚糖凝胶价钱昂贵，要回收再生，避免损耗，严禁倒掉! 【实验报告第二部分（实验记录）：①主要实验条件（如材料的来源、质量；试剂的规格、用量、浓 度；实验时间、操作要点中的技巧、失误等，以便总结实验时进行核对和作为查找成败原因的参考依 据）：②实验中观察到的现象（如加入试剂后溶液颜色的变化） ；③原始实验数据。评 分（满分20分）：XX 主要实验条件： 1、 0.3mol/LpH6.5醋酸鞍（NHAQ缓冲液:称取NHAC23.12g，加蒸镭水800ml溶解，滴入稀 氨水或 稀醋酸液（注意混合均匀），调节pH至6.5后，补加蒸馆水至1000ml。 2、 0.06mol/LpH6.5 NH 4AC缓冲液：取上液用蒸馆水做5倍稀释。 3、 0.02mol/LpH6.5 NH 4AC缓冲液：取上液用