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Brdu检测细胞增殖实验 实验操作： 铺细胞，每个3. 5cmdish10万个，在37°C、5%C02孵箱中培养72h （细胞密度至50-60% 左右）。 Brdu （5-漠-2’ -脱氧尿昔）加入培养细胞中，1mg/ml,标记48h。（量：Brdu以铺满整 个dish底面为准。） 固定：PBS洗细胞爬片3次，每次5min,在摇床上晃动清洗，4%PFA固定30mino 变性：将固定好的细胞爬片用PBS洗3次，每次5min, 2mol/L的HCI在37C条件下变 性5min,可放置于37C恒温孵箱，应用封口膜把培养皿封好o （120r/m） 中和：0.1mol/lL 的硼酸钠（PH8.3）中和 10min, PBS 洗 3 次，每次 5min° （50r/m） 加入 1ml 的 0. 2%Tr itonX-100, 10min? 吸出 TritonX-100,用 PBS 洗 3 次，每次 5min。 加入1ml 3戋的8SA封闭，室温1h,可在摇床上晃动。 吸出BSA,用PBS洗3次，每次5min。 加一抗（尿嗜哧脱氧核昔Brdu （鼠单抗）1:200）,用伐BSA稀释，4度过夜。 将孵好一抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10mino 加二抗（羊抗鼠IgG/Alexa Fluor 594 1： 100）,用1%BSA稀释,避光室温孵育1ho （60 r/min） 将孵好二抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10mino 加DAPI染细胞核，储存浓度为1mg/ml,应将DAPI完全混匀，可用手弹几下，一般稀 释比例为1:1000 （用PBS稀释），避光室温反应10mino 将DAPI染好的细胞爬片用PBS洗3次，每次10mino 中性树胶封片，荧光显微镜观察，200X镜下取5个视野，计数Brdu阳性细胞和蓝染的 细胞核数目，然后进行统计分析。 试剂配制： Brdu的溶解：室温下，将250mg粉末溶于2. 5ml的DMSO中，储存浓度为100mg/ml分装， 每管120ul, -20C保存。 2 mol/L HCI :取 8. 333mL 12 mol/L HCI 的浓 HCI,加入 DDW 定容至 50 mL。 0. 1 mol/L 硼酸钠：称量 1.907g 硼砂（NazB, ? WH2O 381.36 g/mol）,加入 DDW 定容至 50 mL,调 PH=8.3° 0. 2% Triton X-100：有 0. 5% 的 Triton-100 （2.5 mL 原液溶解于 47. 5 mL 的 PBS 中） ,用PBS稀释至0.2%。 3% BSA：称量 1.5g BSA,溶解于 50 mL 的 PBS 中。 1% BSA：用 PBS 稀释 3WBSA 至 4%FPS:㈱多聚甲醛。 我是用DDW配制的，后来我发现很难溶，磁力搅拌器加热搅拌，虽然温度控制在60 C以下, 也总是担心多聚甲醛分解为甲醛，所以，我就总结为如下：提前配制。 然多聚甲醛溶液（pH7.2） 试剂：多聚甲醛（PFA） 4g DDW 至100ml 配制方法：称取4g多聚甲醛（粉末状），置于三角烧瓶中，加入80mlDDW,放入37恒温水 浴箱，每隔1-2小时摇晃混匀，16-24小时PFA会完全溶解。补充DDW,调节PH值。 实验原理： 免疫染色实验的基本原理 利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并 且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强。利用正常羊血清 封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异性的抗体由于动力学的关系 可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性。二抗可以特 异性识别一抗的Fc区域，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不 同的荧光，从而显示目的基因的表达情况。 BrdU标记原理 细胞增殖周期包括G1、S、G2、M 4个时期，其中S期是DNA合成期，细胞内DNA进行半 保留复制，各种构成DNA的原料掺入到DNA中。BrdU作为一种胸腺嗜喘核昔的类似物（其 化学结构特点是胸腺嗟0定的碱基嗟0定环上与5位C原子连接的甲基被漠代替），像胸腺嗟喘 核昔一样可掺入到细胞合成的DNA中。当细胞处于DNA合成期（S期）而同时又有BrdU存 在时，就会有BrdU掺入新合成的DNA中，只要细胞不消亡，这种BrdU就在胞核的DNA中长 期存留。掺入到DNA的BrdU可通过抗BrdU单克隆抗体在组织切片或细胞爬片上显示。 BrdU抗体比较大，由于DNA双链结构的位阻,BrdU抗体无法直接与双链上的BrdU结合, 必须先用使DNA部分变性，这样变性了的DNA单链上的BrdU才能与BrdU抗体结合，因此做 BrdU细胞增殖实验一定要变性，当然变性