酵母双杂交试验流程.pdfVIP

精品文档 4 月 4 日 划线 配培养基 TE/LIAC PEG/LIAC 配置培养基（ YPD YPDA） 取酵母细胞 划线 30 °生长 3 天。 需要用品：三角瓶 灭菌封口膜 酵母提取物 蛋白胨 注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。 4 月 6 号 星期三 （1） 选 择 2-3mm 的单克隆（枪头吸取）放入 3-5ml 的 YPDA液体培养基， 30°摇菌 200rpm，8h 7 号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于 4 度冰箱保存。 需要用品： 200ul 灭菌枪头、 50ml 三角瓶、 YPDA液体培养基、摇床。 4 月 7 号 星期四 （2） 吸取 2.5-10ul 酵母培养液，加入 25ml YPDA液体培养基，摇菌 16-20h 直到 OD值 0.15-0.3 。 下午 4 点开始 8 号 8 点结束 Tips ：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取 2.5 、5、 10 ul 酵母培养液， 加入 25ml YPDA 液体培养基（转化 5 个以下质粒的话， 25ml 菌量就够后续使用） 。 4 月 8 号 星期五 （3） 将 菌液转移至灭菌的 50ml 离心管中， 用天平配平后， 室温下 700g 离心 5 分钟。 （4） 弃 掉上清，加入 50ml 新鲜的 YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒掉 上清液时要小心操作） 。 （5） 30 °震荡培养，直到 OD值达到 0.4-0.5 （3-5h ）。8 号 8 点开始 下午一点结束 进行以下操作之前，配置好 TE/LiAc 溶液，并准备好冰浴。 （6） 将 上述菌液转移至一个灭菌的 50ml 离心管中， 用天平配平后， 室温下 700g 离心 5 分钟。 （7） 弃 掉上清，用 30ml 无菌水重悬菌体（小心操作） 。 （8） 再 次用天平配平后， 室温下 700g 离心 5 分钟，弃去上清，加入 1.5ml 1.1xTE/LIAC 重悬菌体。 （9） 将 上述溶液转移到灭菌的 1.5ml EP 管中，高速离心 15s。 （10） 弃去上清，加入 600ul 1.1x TE/LIAC ，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。 需要物品： 50ml 灭菌离心管、 50ml 三角瓶、 1.5ml EP管、5ml 灭菌枪头、 1ml 灭菌枪头、 灭菌 ddH2O、 YPDA液体培养基、 1.1x TE/LIAC 。 1.1x TE/LIAC 10ML 10xTE 1.1ml 10xliac 1.1ml Dh2O 8.8ml 。 1 欢迎下载 精品文档 酵母转化 进行以下操作之前，配置适量的 PEG/LIAC溶液，设置水浴锅。 （11） 取适量的 CarrierDNA ，沸水浴变性 5-10min ，后立即置于冰水混合物中。 （每转一个质粒需准备 5ul CarrierDNA ，每 10 个样多准备 5ul ） （12） 取数支灭菌的 1.5ml EP 管编号，置于冰水混合物上冷却。 （13） 每个 EP管中加入 5ul 变性后的 CarrierDNA ，再加入 5ul 待转化的质粒 DNA，用枪头混匀。 （14） 向每个 EP管中再加入 50ul 感受态细胞，轻敲管壁混匀（不要用枪头吹打） 。 （15） 向每个 EP管中再加入