免疫共沉淀技术.pptVIP

免疫共沉淀技术;Part 1: IP;免疫沉淀定义; 免疫沉淀步骤;免疫沉淀原理图解;免疫共沉淀定义; 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。;免疫共沉淀原理图解;蛋白A ， 蛋白B 抗A抗体C进行洗脱 抗B抗体D进行验证;相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态； 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响； 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。;可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； 如用western blot检验，必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果，实验本身具有冒险性。;实验的关键;Part 3:CO-IP与质谱分析;CO-IP与质谱分析;Part 3:CO-IP;Part 4: 应 用;P53基因为一种人体抑癌基因人体癌症发生约一半由于该的基因突变失活。 抗p53抗体与HNE1和HNE2总蛋白进行免疫共沉淀 SDS分离免疫沉淀复合物 切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析，得到相应的肽序列标签 搜索数据库 分析目的蛋白相关数据;构建p3XFLAG-GCP 和pCMV-myc-LGL质粒 两质粒共转染293T细胞 SDS分离免疫沉淀复合物 用anti-Flag抗体共沉淀 LGL蛋白，用anti-myc抗体验证。;利用微孢子虫胞壁蛋白制备2株单抗，WB鉴定分别G10识别虫体蛋白的三种成分，B10识别55KD左右一种成分。 裂解虫体提取总蛋白利用制备的单抗进行免疫共沉淀 切取结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析，得到相应的肽序列标签 鉴定得出结论G10识别的70KD左右条带为热休克蛋白70，B10识别的是一种未曾报到的蛋白，分析得到其相关信息;THE END