实验十血液转氨酶(谷丙转氨酶)活力的测定(精选.).pdfVIP

实验十、 血液转氨酶（谷丙转氨酶）活力的测定 （实验：肝脏谷丙转氨酶活力测定 ） （本实验分 2 个实验完成：一、制作标准曲线 二、测酶活力和总结。或就做二就可以） 【目的和要求】 1、 了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义， 2、 学习转氨酶活力测定的原理和方法。 3、 熟悉分光光度计的使用。 【原理】 生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶， 能催化α - 氨基酸的α - 氨基与α - 酮基酸的α - 酮基互换， 在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的最适 pH 接近 7.4 ，它 的种类甚多，其中以谷氨酸 - 草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶）和谷氨酸 - 丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨 酶）的活力最强。它们催化的反应如下。 正常人血清中只含有少量转氨酶。当发生肝炎，心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加， 所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。 测定转氨酶活力的方法很多， 本实验采用分光光度法。谷丙转氨酶作用于丙氨酸α - 酮戊二酸后，生成 的丙酮酸与 2 ，4- 二硝基苯肼作用生成丙酮酸 2 ，4- 二硝基苯腙。 丙酮酸 2，4- 二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，其吸收光谱的峰为 439 —530nm ，因此在波长 520nm 处 吸光度度增加的程度与反应体系中丙酮酸与 α-酮戊二酸的摩尔比基本呈线性关系，故可藉可用分光光度法 测定。从丙酮酸 2 ，4- 二硝基苯腙的生成量，可计算酶的活力。 【试剂和器材】 一、试剂 1. 试管及试管架 2. 吸管 3. 恒温水浴 4. 分光光度计 5、移液管 6、电子天平 7、研钵 word. 8、容量瓶 9、冰箱 二、器材 1、标准丙酮酸溶液 [标准丙酮酸 （500 μg/ml）] ：准确称取纯化的丙酮酸钠 62.5mg ，溶于 pH7.4 0.1M 的 PBS 中，定容到 100ml 。现用现配。 2、谷丙转氨酶底物： 0.90g L- 丙氨酸， 29.2mg α- 酮戊二酸，先溶于 pH7.4 0.1M 的 PBS 中。然后用 1 M NaOH 调节 pH 到 7.4，再用 pH7.4 0.1mol/L 的 PBS 定容到 100ml ，贮存于冰箱中，可使用 1 周。 2 4 2 4 3、0.1mol/L pH7.4 PBS ：称取 13.97g K HPO 和 2.69g KH PO 溶于蒸馏水中，定容到 1000ml 。 4、0.02% 2.4- 二硝基苯肼溶液 ：称取 20mg 2.4- 二硝基苯肼溶于少量的 1mol/L HCl 中。 把锥形瓶放在 暗处并不时摇动（或 加热溶解 ），待 2，4- 二硝基苯肼全部溶解后， 用 1mol/L HCl 定容到 100ml 。滤入棕色 玻璃瓶内置 [ 冰箱内保存 ] 。 5、0.4mol/L NaOH ：称取 16g NaOH 定容到 1000ml 。 6、0.9% 生理盐水 ：称取 0.9gNaCl ，定容 到 100ml 。 【操作方法】 一 、标准曲线的给制： 取 6 支试管，分别标上 0，1，2 ，3，4 ，5 六个号。按下表所列的次序 添加各试剂。 2,4- 硝基苯肼可与有酮基的化合物作用 形成苯腙。底物中的α - 酮戊二酸与 2 ，4- 二硝基苯肼反应，生成α - 酮戊二酸苯腙。 因此，在制作标准曲线时，须加入一定量的 底物， （内含α- 酮戊二酸）以抵消由α - 酮 戊二酸产生的消光影响。 先将试管置于 37 ℃恒温水浴中保温 10min 以平 衡 内 外