蛋白质类药物分析PPT课件.ppt

第九章 蛋白质和多肽类药物的分析;第一节 概述;一、主要理化性质;（一）高分子特性;1、胶体性质;2、变性与复性;3、凝集（Aggregation）;（二）两性解离与等电点;（三）颜色反应;双缩脲反应;（四）紫外吸收;蛋白质和多肽组成中常含有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸，在远紫外光区（200-230nm）有较大的吸收，在280nm有一特征吸收峰;二、蛋白质和多肽类药物质量标准;（一）原液质量标准;宿主蛋白残留量：≤0.1%，0.05%（见Chp附录ⅨC） 残余抗生素：不得检出（见Chp附录ⅨA） 细菌内毒素：≤10EU剂量（见Chp附录ⅫE凝胶限量试验） 结构确证：等电点（见Chp附录ⅣD）、紫外吸收光谱扫描（见Chp附录ⅡA）、N末端15个氨基酸顺序、肽图（见Chp附录ⅧE）、氨基酸组成;（二）成品质量标准;三、蛋白质和多肽类药物活性及测定方法;（一）生物学活性及比活性测定;（二）生物学活性测定方法分类;（三）生物学活性测定方法选择;（四）生物学活性测定（Chp附录ⅩC）;（五）蛋白质药物的比活性;第二节 蛋白质和多肽类药物分析;一、鉴别;（二）紫外吸收光谱扫描（Chp附录ⅡA）;重组脑利钠肽(rhBNP);（三）免疫印迹;SDS;（四）HPLC法;二、结构确证;（一）等电点测定（Chp附录ⅣD）;方法： 1）等电聚焦电泳法（IEF）： 2）毛细管电泳法（CE）：该法用紫外检测，适用于某些不易染色的Pr/多肽，如EGF、hCGRP等制品的测定 标准:标准：有明显主带、理论值±0.5pH范围、批与批间一致 ;（二）末端序列分析（Chp附录ⅧE）;de novo Protein Sequencing;1、N-端测序;268nm;2、C-末端测序;4种常用羧肽酶 ;19种标准氨基酸色谱图;（三）肽图分析（Chp附录ⅧE）;化学裂解法：非特异性降解，裂解位点少 蛋白酶裂解法：特异性降解，裂解位点较多 特殊处理: 二硫键、空间构象较复杂特殊产品;肽图分析方法;Tryptic peptide mapping of recombinant human erythropoietin in phosphate buffer, pH 2.5, with 100 mM heptanesulfonic acid by capillary electrophoresis. The upper without glycosylation (E. coli), the lower with (Chinese Hamster Ovary cells) but subsequently treated with N-glycanase;Comparability Analysis by Peptide Mapping LC-MS/MS for a biosimilar mAb to its original mAb identified an amino acid mutation and several PTMs (oxidation and deamidation), shown by the red arrows, as compared to the biosimilar mAb.;Sequence coverage and Peptide-mass fingerprinting of CRM197 digested with acid hydrolysis and LysCby, respectively.;利妥昔单抗肽图分析;Tryptic peptide map analysis of stability monoclonal antibodies by hydrophobic interaction chromatography. Selected region of tryptic peptide maps of a stability sample held at 40°C for 0 weeks (black), 12 weeks (blue), or 24 weeks (red). ;HPLC pattern of S. aureus fingerprint of human (a) and bovine (b) insulin;（四）氨基酸组成分析;;Representative chromatograms for hydrolysate amino acids and free amino acids ;1、蛋白质及肽水解方法;虽然多肽的氨基酸组成分析已向更灵敏、更精确、更快速以及自动化方向发展和改进，但还没有一种单独适用于所有残基的，并且能在水解液中定量回收的水解方法出现，很多因素如温度、时间