23基因工程载体人工染色体载体XXXX09.pptxVIP

第三节 其他载体;其他载体;一、人工染色体; 人基因组十分庞大，约含4×109bp，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）载体应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（telesome）、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要 ;1、酵母人工染色体;酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）;正常酵母人工染色体含有： * 四膜虫端粒（tel) * 酵母自主复制序列（ARS) * 酵母着丝点 (CEN) * 酵母的选择标记 (TRP1、URA1);;（1）着丝粒区（CEN）;酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重复序列。;位于 SUP4 基因内部。;2、细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome,BAC）;细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC） ;Structure of a bacterial artificial chromosome (BAC), used for cloning large fragments of donor DNA. CMR is a selectable marker for chloramphenicol resistance. oriS, repE, parA, and parB are F genes for replication and regulation of copy number. cosN is the cos site from l phage. HindIII and BamHI are cloning sites at which foreign DNA is inserted. The two promoters are for transcribing the inserted fragment. The NotI sites are used for cutting out the inserted fragment. ;3、PAC载体;二、植物载体;Plant cloning vectors;植物Ti质粒载体;（1）T-DNA区（transferred-DNA regions） T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上导入植物细胞的一段DNA。 T-DNA两端各有一段25bp的重复序列(LB, RB)。 T-DNA携带的致瘤基因是一些与激素合成有关的基因，由于激素合成基因使细胞处于不停的分裂状态，形成冠瘿瘤，不能进行细胞分化。 Ti质粒改造后才能应用于植物的基因工程。 保留T-DNA两端的末端序列，然后用外源DNA插入或直接取代野生型T-DNA的部分基因，使转化的植物细胞不具有成瘤能力。;T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。 Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。;（2）Vir区（virolence region） Vir区段上的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗传过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。Vir区段总长度大约35kb，由7个互补群组成，分别命名为VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG和VirH。 （3）Con区(regions encoding conjugations) 该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。 （4）Ori区(origin of replication) 该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。;Ti质粒分子受到信号分子的激活作用之后，virD基因编码的一种核酸内切酶，先在T-DNA的RB序列中的第3和第4碱基之间切开一个单链缺口，随后在T-DNA同一条链的LB序列中切出第二个单链缺口。 T-DNA便以单链形式释放出来，并在RB序列的引导下定向地转移到寄主植物细胞。 在有关的植物细胞酶体系的催化作用下，合成互补链形成双链形式的T-DNA分子。 在一系列酶的参与下整合进植物基因组。这种整合是一种非正常重组。;2、Ti质粒载体;1） Disarmed Ti vectors;Intermediate vectors;Triparental matin