米氏常数测定方法.pdfVIP

精品文档 酶活米氏常数实验 一、实验前准备 1、24 孔板洗净烘干，准备足够枪头。 2、准备催化剂，在光下呈透明状为分散性较好，否则用超声清洗器（位于化学间）超 声分散 5min ，期间准备底物 （如TMB 或者 ABTS ），浓度依照自己实验的要求定 （10mg/mL 或 5mg/mL ），一般 1mL 足够用，可在 1.5mL 离心管中溶解。 TMB （外间冰箱上层）溶于 DMSO （二甲亚砜，位于化学间王春雨的柜子里） ，ABTS （与TMB 放在一起） 溶于二次水。 3、将缓冲液、催化剂、底物、 H O 、 200 μL 和 10 μL 移液枪、 50 μL 排枪（位于称量处 2 2 上方模拟酶专用枪的柜中） 、96 孔板、 24 孔板、卷纸一起放入纸盒中，放到对面酶标仪前， 开空调定室温 （25 ℃，提醒其他人随手关门） ，24 孔板中其中一排加入适量 H2O2 （每孔 1mL 左右，注意避光， 可在板上盖一张卷纸） ，将缓冲液、 催化剂、 底物放实验台上， 静置 0.5-1h 。 4、记录本上提前写好实验的加样顺序： 催化底物 TMB （或ABTS ）的酶促动力学过程加样顺序：① 200 μL 缓冲液 ② 10 μL 催 化剂 ③底物 TMB （ABTS ） (0 ，0.5， 1，2 ，4，6 ，8 ， 10 μL) ④ 32 μLH 2O2 （排枪加） 催化底物 H2O2 的酶促动力学过程加样顺序：① 200 μL 缓冲液 ② 10 μL 催化剂 ③ H2O2 （2 ，4 ，6， 8， 10 ，16，32 ，64 μL ） ④ 10 μL 底物 TMB （ABTS ）（排枪加） 数据记录按下表记， Code 为每次读板时的微孔板编号， Time 为对应的读板时的时间， 一般 30s 读板一次，可根据反应的快慢来确定读板的时间。 Code 1 2 3 4 5 6 7 Time TMB 0 0.5 1 2 4 6 8 10 V01 Code 1 2 3 4 5 6 7 Time H2O2 2 4 6 8 10 16 32 64 V01 二、实验 1、打开酶标仪（开关在仪器后部，若仪器没反应，请检查电源是否接通） ，密码为 5 个 0，按 Enter 键进入系统。电脑开机，密码为 mby-nano ，双击酶标仪软件图标 ，出 现 登 录 框 ， 直 接 点 击 “登 录 ”， 进 入 酶 标 仪 控 制 界 面 精品文档 精品文档 ，若底物为 TMB ， 选择“铁动力学” (波长为 650nm) ，选择模 板 1 精品文档 精品文档 ； 打 开 电 脑 内 置 时 钟 ， 若