第四章-酶学分析技术PPT课件.ppt

第四章 酶学分析技术;酶是生物体内活细胞合成的具有高效、特异催化作功能的蛋白质。;底物(substrate, S)：被催化的物质。 产物(product, P)：反应生成的物质。 酶促反应：酶催化的反应。 酶活力：酶所具有的催化能力。;常见酶类;一、酶活性;二、酶活性单位;1．惯用单位： ;;三、酶促反应动力学 ;（一）延滞期（lag phase、延迟期 ）;（二）线性期;（三）非线性期（偏离线性期、平坦期 ）;偶联：工具酶与待测酶、工具酶与工具酶之间的联合。 ;表7-2 常用工具酶的名称及其缩写符号; 常用品工具酶主要是氧化还原酶类，部分转移酶类和水解酶类。 工具酶的质量要求 工具酶的用量一般较多，故要求工具酶来源广泛，价廉易得，纯度要求不太高，可降低制备成本，但对工具酶中的杂质也要有一定的限制，以保证工具酶有一定的比活性，减少或避免一些能干扰测定的副反应。;NAD(P)＋或NAD(P)H偶联的脱氢酶及指示反应，NADH和NADPH在340nm有光吸收特性，可用紫外分光光度计直接测定，另外，NAD(P)H还有强烈荧光，其激发光波长为365nm，荧光波长为460nm，荧光法的灵敏度比分光光度法高。 如 ALT测定 工具酶是LDH;二、 酶活性的测定方法;1、定时法; 2. 连续监测法（continuoue monitosing） 每隔一定时间（10～60s）连续测定酶反应 中产物或底物的变化 量称为连续监测法。 又称动力法或速率法， 终点法的测定两个时 间点，该法进行多点 连续测定。; 优点：多点测定结果，连接成线，很容易找到成直线的区段，因而可选择线性反应期来计算酶活性，不需终止反应，测定结果较准确。省时、省试剂。 缺点：分光光度计必须有保温装置，而且P或S应是可直接测定的化合物，如需加入其他试剂则必须考虑它们对待测酶活性是否有影响。; 3. 平衡法（end-paint amalyin）测定酶 反应开始后某一段时 间内(从t1→t2)产物或 底物的总变化量称为 终点法。而t1和t2是 反应历程中的两个点， 故又称两点法。; 优点：简便，测定产物时，酶反应被终止，显色剂的选择只考虑对酶活性的影响，分光光度计不需保温装置。 缺点：无法了解这段时间的反应是否都是零级反应，故难以保证结果的真实性。;计算公式:;第三节 影响酶活性测定的因素 一、标本 1. 溶血 RBC中某些酶活性比血高，如LDH高150倍，AST高15倍，ALT高7.5倍。 2. 抗凝剂 某些酶可被抗凝剂抑制，如EDTA、草酸盐，可抑制需Ca2+的AMS和需Mg2+的CK、5NT、ALP等，酸酶活性测定都用血清。 3. 样品存放时间，各种血清酶稳定性不同，如ACP、CK在室温下迅速失活，AMS、GGT则很稳定。;二、测定条件的影响 1. 温度 温度对酶活性的影响包括两个方面，一方面是温度升高，反应速度加快。另外一方面温度升高，会发生热变性，使酶活性降低。 ; （1）温度的选择 37℃反应速度快，单位时间反应物质变化量大，测定灵敏度增加，保温时间短，25℃、30℃可使单位时间的散热较少，温度便于恒定，很多实验数据的物理化学较难定在30℃进行，IFCC建议30℃作为参考方法的标准温度。 （2）温度系数 将温度每升高10℃后反应速度相当于原来的倍数，称为温度系数(Q10)。Q10表示温度对反应速度影响的大小。; 2. pH （1）改变底物的解离状态，影响酶与底物结合。 （2）改变酶活性中心必需基因的解离状态，影响酶活性。 （3）改变酶的三维空间构象，使酶变性。 （4）使亚基解聚; 3. 缓冲液性质 酶活性不仅受缓冲液pH影响，也受缓冲液性质的影响，选择缓冲液应考虑的因素。 （1）缓冲液中弱酸的解离数pka必须接近酶测定时的Ph。如ALT测定pH7.4（磷酸pka6.7）LDH测定pH8.8，（二乙醇胺pka8.8）ALP测定pH10（碳酸pka10.32）。; （2）缓冲液对酶活性无抑制作用，如甘氨酸对LDH、ALP有抑制作用。 （3）缓冲液在酶反应体系中不会发生降解或破坏。 （4）缓冲液在可见光区或紫外区没有成仅有极低光吸收现象。;测定酶活性时的注意事项