核酸的性质及研究方法.pptxVIP

1;??★ 鉴定纯度 纯DNA的A260/A280应为（） 纯RNA的A260/A280应为。 若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。 ★?? 含量计算 1 A260（OD260）值相当于：50ug/mL双螺旋DNA 或：40ug/mL单链DNA（或RNA） 或：20ug/mL寡核苷酸 ★ 判断DNA是否变性 在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应） 在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）;二 核酸的变性;?★ 变性因素 ： 热变性 酸碱变性（pH小于4或大于11） 变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛） ★ 变性后的理化性质 ： 260nm吸收值升高。 粘度降低，浮力密度升高。 二级结构改变，部分失活。 ;★?? 增色效应与减色效应 增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大 减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。;1 Tm：熔解温度（melting temperature）; 熔解温度（Tm） 浓度50ug/mL时，双链DNA A260，完 全变性（单链）A260当A260增加到最大 增大值一半时，即时，对应的温度即为Tm。 DNA的Tm一般在82—95℃之间;2 影响DNA的Tm值的因素;② G-C含量与Tm值成正比。测定Tm，可推知G-C含量。 G-C%=（）;③ 介质中离子强度 离子强度高，Tm高。;三 核酸的复性;; ★ 热变性DNA在缓慢冷却时可以 复性，快速冷却不能复性。 ★ DNA片段越大，复性越慢； ★ DNA浓度越大，复性越快。 ★ 复性速度可用Cot衡量。;Cot 是Co 与 t 的乘积，Co 为变性DNA（复性前） 的原始浓度，以摩尔浓度（mol/L）表示，t为复性 时间，以秒（s）表示。 复性分数 f = 1/1+kCot Cot ? 是指复性完成一半时的Cot值。;;分子杂交;分子杂交的原理示意图;Southern印迹法; 四 核酸的水解; 核酸的酶水解;内切核酸酶对RNA的水解位点示意图;限制性内切酶;;限制性内切酶的命名和意义; 限制性内切酶是分析染色体结构、制作DNA限制图谱、进行DNA序列测定和基因分离、基因体外重组等研究中不可缺少的工具，是一把天赐的神刀，用来解剖纤细的DNA分子。;外切核酸酶对核酸的水解位点;第二节 核酸研究的技术和方法一 DNA的化学合成：; 二 ??酸的分离、纯化和定量; 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。 DNP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。 水相中的DNA可被0.3M NaAC-70%乙醇沉淀;不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来 这一方法常用于质粒DNA的纯化。; ◆ 紫外分光光度法(A260) ◆ 定磷法（DNA含磷9.2%，RNA含磷9.0% ） ◆ 定糖法（DNA；二苯胺法， RNA；苔黑酚法） ; 核酸的纯度 ;三 DNA一级结构的测定;(一) 末端终止法; DNA是一种双螺旋分子，其复制是在DNA聚合酶催化下，以原来的两条母链上的核苷酸序列为模板，通过互补配对的方式合成新DNA链的过程。复制需要引物和四种dNTPs，总是从5′-端向3′-端进行。细胞内DNA复制的引物一般是RNA，但体外DNA复制的引物可以是人工合成的与模板链互补的一段寡聚脱氧核苷酸。复制开始于引物3′-端自由的羟基，依据碱基互补配对的原则，不断地形成新的3′,5′-磷酸二酯键，使DNA链得到延伸，直到一个新的DNA分子完全被合成。 ;第35页/共57页;第36页/共57页;第37页/共57页;;;（二） 化学断裂法 Maxam-Gilbert ， 1977 原理： 利用特异性的化学裂解法，制备出长度只差一个核苷酸 的片段群，然后将此片段群经侧序胶电泳和放射自显影 得到测序图谱。 32P-GCTACGTA： 在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT 在G处： 32p ，32p-GCTAC 在C处：32P-G和 32P-GCTA 在T处：32P-GC和32P-GCTACG;化学断裂法;第42页/共57页;(三)