核酸的鉴定与保存.pptxVIP

1; 核酸的结构与功能是分子水平生命活动的基础； 内源基因的突变、表达及调控的异常和外源致病基因的侵入是人类疾病发生、发展的根源。;　DNA、RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象。 DNA、RNA的分离纯化是分子生物学研究及对疾病进行分子诊断的最基础工作。;核酸分离纯化的原则 　　一、 保持核酸一级结构的完整性 　　二 、尽可能提高核酸制品的纯度;提取DNA总的原则;第一节 核酸分离纯化的设计及原则;第一节 核酸分离纯化的设计及原则;一、材料与方法的选择;一、材料与方法的选择;（一） 材料与方法的选择; 1、保持核酸碱基序列的完整性 2、尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度 3、保持核酸的完整性 应尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间 尽量避免各种有害因素对核酸的破坏 ;二、技术路线的设计;（一）核酸的释放;表５-１ 各种组织细胞破碎方法;核酸分子抽提的技术设计;;; 应该清除的杂质主要包括三部分 1、非核酸的大分子污染物：蛋白质、多糖及脂类 物质等 2、非需要的核酸分子：分离某一特定的核酸分子 时，其它的核酸分子皆为杂质 3、加入的有机溶剂和某些金属离子;（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤;三、核酸的鉴定与保存;（一）核酸的鉴定; ⑴ 紫外分光光度法：该法是基于核酸分子 中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收 紫外线，其最大吸收波长为260nm。 ; 各种碱基的紫外吸收光谱; ⑵　荧光光度法：核酸的荧光染料溴化乙锭嵌 入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激 发下发出红色荧光，且荧光强度的积分与 溶液中核酸的含量呈正比。 ;EB与DNA的结合 ; ⑴ 紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280 的比值来判定有无蛋白质的污染，比值升高与 降低均提示不纯。 在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280为 纯RNA的A260/A280比值为;1. DNA或RNA的定量 OD260相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 RNA纯品: OD260/OD280 ;浓度鉴定; ⑵荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电 泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较 RNA大得多，电泳迁移率低。;;⑴ 琼脂糖凝胶电泳法： 　 以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可 判定核酸制品的完整性。基因组DNA片段 的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果 发生降解，电泳图呈拖尾状。;DNA片段的降解;完整或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带荧光强度积分应呈特定的比值，沉降系数大的核酸区带，电泳迁移低，荧光强度积分高；反之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。 ; 一般而言，28S（23S）RNA的荧光强度约为18S（16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解。若 在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA 的污染。 ; 总RNA电泳图谱;;（二）核酸的保存;1、短期贮存： 4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。 TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于时DNA容易变性。 2、长期贮存： TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。;2、RNA的储存;第二节 真核基因组DNA的分离纯化;生物体组织细胞;第二节 真核基因组DNA的分离纯化;DNA酚抽提法示意图; 一、酚抽提法;;DNA样品准备;;;;;为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？;DNA的沉淀;DNA的浓缩; DNA的检测;二、甲酰胺解聚法;; 三、玻棒缠绕法;;四、其它方法;五、 DNA片段的纯化;;六、 DNA片段的回收;六、 DNA片段的回收;1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法 2.电泳洗脱法 3.冷冻挤压法 4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法;;;;;;（二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段;至今尚无一种方法既能有效回收DNA大片段或微量的DNA片段，又能同时回收几种DNA片段并有效清除凝胶中酶促反应抑制剂。;第三节 质粒DNA的提取与纯化 ;质粒简介;;;;质粒特性;常用质粒载体;; pUC系统;;质粒DNA的提取和纯化 ;;;2．细菌的收集与裂解;;;质粒DNA提取方