BSA蛋白偶联多肽技术.pdfVIP

1．1．1 多肽合成 按照多肽合成常规操作， 合成来源于上海楚肽生物科技有限公司 （Apeptide CO.,Ltd.) HPLC 检测 纯度为 95% 。多肽 C 端增加的半胱氨酸残基用于以其巯基连接于偶联剂上。 1．1．2 合成多肽与载体的偶联 载体蛋白选择 BSA （Roche 公司），用 SPDP （PIERCE 公司）连接法将合成的多肽与 BSA 进 行偶联： 4.6mgSPDP 溶解于 740ulDMSO ，终浓度为 20mM 。0.1008gBSA 溶解于 2ml PBS-EDTA 溶液 TM 中，室温静置 1h。HiTrap Deaslting column 脱盐柱洗脱多余的 SPDP。4mg 多肽加入偶联好的 BSA-SPDP 体系中室温过夜。 1．1．3 抗多肽抗体的制备 选体重 1. 5～2 kg 的健康雄性新西兰大白兔， 按常规操作卡介苗活化其免疫系统。 将偶联的 BSA- 多肽过滤除菌， 100mg （2ml ）加等体积的不完全佐剂，充分混悬。在新西兰大白兔背部多点皮下注 射， 4 周后加强免疫，其后每隔 2 周进行 1 次加强免疫，注射途径与初次免疫相同，共两次后，检测 效价。耳源静脉采血、分离血清。 1．1．4 多肽抗体的纯化 Protein G 柱分离纯化 IgG 抗体： PBSpH7.4 平衡 Protein G 亲和柱，以 0.1M Gly-HCl pH3.0 洗脱， PBSpH7.4 透析，分装， -20 ℃保存。 1mM 预冷的 HCl 充分膨胀 Sepharose 4FF （GE 公司）后， 15 个 体积的 1mMHCl 清洗去残留的蔗糖，每次清洗 2min 。偶联缓冲液 0.1MNaHCO pH8.3 0.5M NaCl 平 3 衡 2 次。多肽溶于偶联缓冲液，调节 pH 值到 pH8.3 后，加入凝胶，室温混旋 3h。加入 1M 预冷的乙 醇胺混旋 2h 阻断未偶联上的活化位点。 50mM Tris-HCl pH8.0 ，1MNaCl 溶液与 50mM Gly-HCl pH3.5 ， 1M NaCl 交替清洗 8 次。 PBS 缓冲液平衡 10 倍体积。装柱，平衡，上样后以 0.1MGly-HCl pH2.2 洗 脱， PBS 透析，分装， -20℃冻存。 1．1．5 免疫双扩散 在制备的琼脂板上按 7 孔一组的梅花形打孔 （中间1 孔，周围 6 孔），孔径约 5mm ，孔距 2mm~5mm ， 吸取多肽抗原悬液滴入中间孔，等倍稀释的血清分别加入外周的对称孔中。 37 ℃温箱中作用，于 24h 后观察结果。 吸取血清滴入中间孔， 等倍稀释的多肽抗原分别加入外围的对称孔中， 37℃温箱中作用， 于 24h 后观察结果。 好的设计 + 好的多肽质量是制备好的抗体必要条件！ SPDP 中文名： 3-(2- 吡啶二巯基 )丙酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯 英文名： N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate 分子式： C12H12N2O4S2 ；分子量： 312.37 ；应用：交联氨基和 巯基 外观：白色或浅黄色粉末；储存条件： 0-5 ℃；运输条件：室温；储存条件：冷藏保存 产品描述： SPDP ，一种异 - 双官能试剂，用于结合两种不同的蛋白质，诸如酶和抗体。 SPDP 首 先经由其氨基与一个蛋白质分子反应。 SPDP 向该蛋白质中引入吡啶二硫基，接着该吡啶二硫基由 DTT 还原形成硫醇基。这些硫醇基接着与另一蛋白质分子形成二硫键，从而产生异二聚物蛋白质。 BSA 牛血清白蛋白 BSA ，Bovine Serum Albumin ：1、 在酶切反