聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离血清蛋白.ppt

聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离血清蛋白 【实验目的】 1.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 2.掌握聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳的操作技术 【实验原理】 聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂N,N ’-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂过硫酸铵（简称AP）和加速剂N,N,N’N’-四甲基乙二胺 (简称TEMED)的作用下,聚合交联而成的三维网状结构的凝胶 。 ;聚丙烯酰胺凝胶电泳分离原理 分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而???现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。 电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。 浓缩效应;【实验器材】 样品：血清 凝胶储备液： 1号液：pH8.9 Tris~HCl缓冲液+TEMED 2号液：Acr + Bis 3号液：AP 电泳缓冲液 ：pH8.3 的Tris-Gly 缓冲液 染色液：氨基黑溶液 脱色剂：冰乙酸 ;【实验器材】 电泳仪、圆盘电泳槽、电泳玻璃管、青霉素小瓶盖、微量注射器 、长针头注射器、烧杯、移液管、ParaFilm膜。;【实验步骤】 1.凝胶的制备 （1）准备工作 ：用ParaFilm膜密封细橡皮塞的一端，塞入放到木质试管架上的小瓶塞中；;（2）制备小孔胶（分离胶） 凝胶浓度: 7.5%;2. 灌胶，装胶 用滴管吸取凝胶沿管壁装入玻璃管中，检查管内无气泡，加完凝胶后沿管壁缓缓注入几滴蒸馏水，聚合约40-60分钟； 时间到后，轻轻取下管底部的橡皮塞和ParaFilm膜，用滤纸吸取凝胶上方水层，将凝胶管垂直插入电泳槽圆孔中并尽量使各管高度一致，其余孔用胶塞堵住，电泳槽内加注电泳液；;3. 加样： 用微量注射器吸取20/50ml 的样品（含溴酚蓝），沿内壁缓慢加入，注意观察样品的状态变化； 4. 电泳： 负极在上，正极在下，电流调节到2mA/管，开通电源；2min后，电流调节到5mA/管，电泳约1h左右，直到溴酚蓝跑到凝胶底部。;5. 剥胶 ;6. 固定与染色： 将取下的胶条放入染色液中，在室温下，固定染色10min。 7. 脱色： 将染色完毕的胶条用自来水冲洗后浸泡在脱色液中； 8. 观察并图示记录实验结果。