口腔免疫研究方法.ppt

口腔免疫研究方法;免疫荧光技术 酶联免疫吸附试验 蛋白质印迹 流式细胞术;一、免疫荧光; 1. 概述 免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术基础上建立起来一项技术。 该技术关键优缺点 关键优点: 特异性强、敏感性高、速度快。 关键缺点: 非特异性染色问题还未完全处理, 结果判定客观性不足, 技术程序也还比较复杂。;2. 基础原理; 间接免疫荧光法: 间接法与间接ELISA相同, 引入标识二抗, 能够检测抗原, 也能够检测???体。 优点: 一抗能够结合多个标识二抗, 固灵敏度比直接法高。 缺点: 比直接法易出现非特异荧光。;免疫荧光原理示意图;3.免疫荧光试验过程;4. 免疫荧光技术相关应用;② 病原体检测 ;③ 免疫病理检测;5. 口腔应用举例;直接免疫荧光IgG 上皮棘层呈翠绿色渔网状荧光;细胞免疫荧光技术 组织免疫荧光技术;二、酶联免疫吸附试验;1. ELISA原理;2. 基础类型;间接法检测特异性抗体;优点: 只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测对应抗体方法 操作简单迅捷 缺点: 可反复性差 通常见于抗体效价检测和一些疾病早期诊疗;双抗体夹心法检测可溶性抗原;优点: 待测抗原需要≥2个抗原决定簇, 所以适合大分子抗原检测, 通常在分子量5000D以上; 因为增加了一层抗体, 提升了特异性检测灵敏度, 尤其是改良双抗夹心法; 只要取得针对受检抗原特异性抗体, 就可用于包被固相载体和制备酶结合物就能够建立此法; 反复性很好; 缺点: 操作复杂, 费时费力;3. ELISA 基础操作步骤;4. ELISA 数据处理;5. 结果判定;定量试验 1. 标准品和待测样品OD值减去空白孔OD值 2. 绘制标准曲线, 计算出待测样品浓度 依据绘制标准曲线以及待测样品OD值可计算出待测样品浓度。;6. 口腔应用实例;ELISA方法检测龈沟液中细胞因子（如IL-8/IL-4/TNF-α等）浓度: 将标本于冰箱内取出, 室温解冻, 4℃离心后取上清备用。利用检测试剂盒, ELISA检测龈沟液中细胞因子浓度。;用途: 血清、血浆、细胞上清液、组织匀浆及相关液体样本中免疫炎性因子、抗原和抗体检测。;三、Western Blot;印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上, 以后利用对应探测反应来检测样品一个方法。 1975年, Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上, 并利用DNA－RNA杂交检测特定DNA片段方法, 称为Southern印迹法。 以后大家用类似方法, 对RNA和蛋白质进行印迹分析, 对RNA印迹分析称为Northern印迹法, 对单向电泳后蛋白质分子印迹分析称为Western印迹法, 对双向电泳后蛋白质分子印迹分析称为Eastern印迹法;2. Western Blot基础原理;Western blot原理;Anode - 内槽缓冲液带有负电荷，与凝胶顶部接触;3. Western Blot操作步骤;常见仪器;4. 相关应用;临床: 在艾滋病病毒感染中, 依据出现显色线条位置能够判定有没有针对病毒特异性抗体, 以此法作为确诊试验。 使用印迹抗原来测定多种病人抗体谱已经直接作为临床免疫检验手段, 被称之为确定试验“金标准”。?;5. 口腔应用实例;取蛋白分别经10%SDS、5% PAGE凝胶电泳后, 抗原转至NC膜。 放入 5%脱脂奶粉中封闭, PBS洗膜。 加入一抗（鼠抗人MMP- 28多克隆抗体）4℃过夜, 洗涤后加入二抗（兔抗鼠I gG）37℃下孵育1h, DAB显色, PBST漂洗, 密度扫描并拍照。 对 MMP-28表示与 OLP临床参数进行相关性分析。;为何要作蛋白质印迹试验？ 研究部分体外蛋白质分子, 寻求目蛋白是否存在样品当中 蛋白质表示情况, 上调或下调表示, 在不一样品中, 如疾病和正常样品之间表示差异性。;四、流式细胞术;1. 流式细胞术概述; 流式细胞术最大特点是能在保持细胞及细胞器或微粒结构及功效不被破坏状态下, 经过荧光探针帮助, 从分子水平上获取多个信号对细胞进行定量分析或纯化分选。 ;采取激光作为激发光源, 确保其含有愈加好单色性与激发效率; 利用荧光染料与单克隆抗体技术结合标识技术, 确保检测灵敏度和特异性; 用计算机系统对流动单细胞悬液中单个细胞多个参数信号进行数据处理分析, 确保了检测速度与统计分析正确性。 ;流式细胞仪台式机——FACSCalibur;大型机——FACSVantage SE;3. 流式细胞仪关键结构;;;FCM液流系