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TCID50 测定方案 39 简介 TCID50(Tissue Culture Infective Dose) ，半数组织培养感染量，又称 50%组织细胞感染量，指能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞病变 (Cytopathic effect ，CPE)的病毒量。 将不同稀释度的病毒接种到 96 孔板上培养的单层细胞上。观察细胞病变，待细胞不再病 变时记录每个稀释度出现病变和未出现病变的孔数， 按照 Reed-Muench 公式计算 TCID50 值。 试剂 试剂 来源 保存条件 DMEM-basic 培养基 Gibco ，上海 4℃保存 胰蛋白酶 Gibco ， - 20℃冻存 胎牛血清 Fetal bovine serum Hyclone ， - 20℃冻存 PBS Hyclone ， - 20℃冻存 仪器与耗材 仪器 规格 耗材 规格 CO2 培养箱 生物安全柜 细胞培养瓶 无菌离心管 2 25cm 15mL， 50mL 倒置显微镜 一次性移液管 1mL， 2mL，5mL， 10mL 显微照相系统 细胞培养板 96 孔 高速冷冻离心机 电子天平 移液器 液氮罐 电冰箱 细胞及培养基 DF-1 细胞株 细胞生长液 （ 500mL）： 20%FBS（胎牛血清） +1%双抗（青链霉素） +剩余用 DMEM 100mL 5mL 395mL 细胞维持液 （ 50mL）： 1%双抗（青链霉素） + DMEM（无血清） +1%FBS 49mL 细胞冻存液 （ 50mL）： 70%DMEM-basic + 20%FBS + 10%DMSO 35mL 10mL 5mL 4℃保存备用 病毒株及培养方法 禽流感病毒 （ Avian influenza virus ， AIV）， H5N1 株； 禽白血病病毒 （Avian leukosis virus ， ALV）， HPRS-103 株； 禽传染性支气管炎病毒 （Infectious bronchitis virus ， IBV）， H52 株； 禽传染性法氏囊病病毒 （ Infectious bursal disease virus ，IBDV）， B87株。病毒培养方法： DF-1 细胞培养和鸡胚培养。 操作步骤 DF-1 细胞的传代 吸弃细胞培养瓶中旧的培养液； 加入灭菌 PBS 5mL清洗细胞，重复两次； 加入 1ml %的胰蛋白酶消化； 约 40s 左右（置于显微镜下观察，发现细胞圆缩、胞间隙增大） ，站立放置细胞瓶，并加入细胞生长液 10mL，反复吹打瓶壁细胞 ( 吹打过程要轻柔且尽可能不出现泡沫 ) ，并将细胞吹散，之后取两只新的细胞培养瓶，开盖待用； 向原细胞瓶中再加入细胞生长液 10mL，并吹吸混匀，然后吸取约 7ml 细胞悬液加入到 2 个新的培养瓶中； 37℃ 5%CO2 中培养 3 天，期间观察细胞生长情况，细胞长至占瓶壁 70%-80%时可接种病毒，长满可传代。 DF-1 细胞的冻存 1. 取生长 48-72h 的 DF-1 细胞，吸弃旧的培养液； 2 . 吸取无菌 PBS 5mL清洗细胞，重复两次； 加入 1mL % 胰蛋白酶消化； 约 40s 左右后，加入 3mLDF-1 细胞生长液终止消化，并吹打细胞瓶壁，使细胞悬浮于生长液中； 吹吸细胞，使混匀，之后将细胞悬液转移至 50mL 无菌离心管中； 1000rpm ，室温离心 10min； 弃上清，加入细胞冻存液，置 -20 ℃、 -80 ℃梯度冻存，最后保存于液氮中。 TCID50 的测定 96 孔板培养细胞 取 1 瓶长满的细胞，吸弃培养瓶中旧的培养液； 吸取无菌 PBS 5mL清洗细胞，重复两次； 向瓶内加入 1ml 胰蛋白酶消化； 约 40s 左右后（置于显微镜下观察，发现细胞圆缩、胞间隙增大） ，站立放置细胞瓶，并加入细胞生长液 10mL，反复吹打瓶壁细胞 ( 吹打过程要轻柔且尽可能不出现泡沫 ) ，并将细胞吹散； 吸取一滴细胞悬液置于细胞计数板上，对细胞进行计数； 加入细胞生长液稀释细胞悬液至含细胞万个 /mL（约 4 万个 / 孔）； 取一块 96 孔板，每孔加 100μl的细胞悬液（枪头紧贴孔的一侧壁且不接触孔底，缓缓 将细胞打下去， 每加 8 孔，将未加的细胞悬液均匀混合） ，铺好后静置 5min 观察细胞， 再放入 37℃培养箱中培养至细胞长到 70%-80%。 96 孔板接种病毒 将病毒室温解冻。 吸取细胞维持液 9mL，再吸取 1ml 病毒液， 用 μm微孔滤膜过滤至 15ml 无菌离心管中，记为 1 号管； -2另取 10 只无菌离心管，编号 2-11 ，将 1 中病毒悬液用细胞维持