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基因功能研究方法专业知识;伴随生物学研究在分子水平上不停深入和推进, 越来越多新基因得以成功克隆, 对新基因功效研究显得日益关键, 这也是后基因组时代功效基因组学关键研究内容。;1.微阵列分析; 原理: 将成千上万条DNA片段(cDNA、表示序列标签(expressed sequence tag ,EST) 或特异寡核苷酸片段) 按横行纵列方法有序点样在固相支持物上。固相支持物为硝基纤维膜或尼龙膜时称为微阵列。 固相支持物改为指甲盖大小玻片或硅片时所形成微阵列就称为DNA芯片。;微阵列法分析过程: 首先用来自不一样生理状态和发育阶段mRNA 作为模板,以放射性同位素或荧光标识dNTP为底物反转录合成cDNA; 其次将所得cDNA与微阵列或DNA芯片进行杂交; 最终经过计算机对结果进行判读和处理,这么就能够知道芯片中哪些基因在细胞里表示,哪些基因不表示;一样也能够测知哪些基因表示水平高,哪些基因表示水平低。;芯片制作:;接触点样法: 是将样品直接点在基体上。优点是仪器结构简单、轻易研制, 是一个快速、经济、多功效仪器, 能够在3.6cm2面积内点上10000个cDNA; 不足是每个样品都必需合成好、经过纯化、事先保留。;喷黑法:是以定量供给方法, 经过压电晶体或其她推进形式从很小喷嘴内把生物样品喷射到玻璃载体上。一样需要合成好纯样品, 包含cDNA、染色体DNA片段和抗体。在1cm2面积上可喷射10000个点。;原位合成法: 关键是美国Affymetrix企业开发寡聚核苷酸原位光刻DNA合成技术。 原理: 在合成碱基单体5’羟基末端连上一个光敏保护基, 利用光照射使羟基端脱保护, 然后逐一将5’端保护核苷酸单体连接上去, 这个过程反复进行直至合成完成。;原位合成法优点: 合成循环中探针数目呈指数增加, 在1.6cm2面积上合成40万组寡核苷酸。;2.基因转导技术; 2.1 物理方法 1. DNA直接注射法: 是目基因导入最简单方法, 但注入量有限, 能够接触到细胞有限,故取得细胞转化率很低, 多经过肿瘤局部多点注射给药。 2. 颗粒轰击技术:将目基因包被金属以后,利用高压发射装置, 加速包裹目基因金属颗粒进入细胞,从而提升肿瘤细胞转化率。 ;;;2.3 生物学方法 (关键经过构建病毒载体来完成): 病毒表示载体:以病毒为载体介导基因转移技术。 因其转染效率高、目基因可稳定表示等优势被广泛应用。  ;;;3.反义技术;;;; ;反义技术两种技术路线:; ;4.基因敲除和敲入;优点: 此技术整合位点确定、正确, 转移基因频率较高, 既能够用正常基因敲除突变基因, 以进行性状改良和遗传病诊疗; 又能够用突变基因敲除正常基因, 以研究此基因在发育和调控方面作用。;现在利用基因敲除得到转基因动物程序可简述以下: (1)克隆基因组中某一基因全部或部分DNA序列, 用插入、删除、置换、修饰等手段重建DNA序列,使之成为靶载体; (2)将靶载体导入小鼠胚胎干细胞中,使外源DNA与胚胎干细胞基因组对应部分发生同源重组,将靶载体DNA 序列整合到内源基因组中; ;(3)将胚胎干细胞受体细胞注入小鼠囊胚, 将这些囊胚导入假孕母鼠子宫中, 产生雄性嵌合鼠子代与正常雌鼠交配即可取得生殖系统携带该基因纯合鼠, 进而分析被剔除基因功效。;4.2 基因敲入 基因敲除技术已经成为研究基因功效强有力手段, 但对于很多基因来说, 简单失活常造成令人费解无改变表型。最常见解释是一些其它基因替换了靶基因功效, 但要在一般基因敲除小鼠中证实这一点十分困难。基因敲入即经过基因打靶用一个基因替换另一个基因以确定它们是否含有相同功效。;基因敲入设计, 是一个类似于一般基因敲除法一步同源重组过程。不一样之处于于, 设计打靶载体时需将靶基因第一个外显子N-端序列缺失, 并将新替换基因置于靶基因调控序列之下, 使其能正确地根据靶基因调控模式表示。 此方法不仅能用一个基因置换另一个基因, 且能够系统地改变基因结构, 分析其蛋白产物各功效区作用。;5.人工染色体转导;酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC): 是一类酵母穿梭载体, 含有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择标识基因; 还含有酵母菌染色体部分特点。能够接收100-1000kb外源DNA片段。 原理: 酵母人工染色体就是把酵母染色体上与基因复制和表示相关关键组件都组装在质粒上, 令质粒行使酵母转录功效和复制功效。;酵母人工染色体DNA转导方法: 关键有核注射、脂质体介导和酵母原生质体融合等。 优点: 可使导入基因水平与内源基因相当,而且含有类似于天然剪接机理,适适用于复杂基因功效分析。;YAC要含相关键功效成份 ;6.基因诱捕技术;7. 基因编码