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基因工程工具酶;一 概述;细菌R-M体系: 定义: 限制-修饰体系, 细菌可识别本身DNA 和外源DNA, 降解外源DNA—对外源DNA 有抵御力 原理: 修饰酶从SAM（s-腺苷甲硫氨酸）上转 移甲基到特定识别位点特定碱基上, 使DNA 甲基化, 确保内源DNA不被限制酶降解 生物意义: 确保内源DNA不被限制酶降解, 快速降解未被甲 基化外源DNA ※DNA复制过程中甲基化: 模板链是甲基化, 使子代DNA （半甲基化）不被限制酶降解, 甲基化酶再将新合成链甲基 化, 使子代DNA完全甲基化, 预防被内切酶降解;二 限制性内切酶（限制酶???;限制酶识别位点特征: 专一性 大多有4-8bp: 关键是6bp, 富含CG 大多为回文序列: 反向反复序列,易切割出粘 性末端片段 切割位点在识别序列内: 识别位点甲基化不 利于切割;※限制酶识别序列出现几率及酶切片段估算;切割方法: 成黏性末端: 切割位点在识别序列中心轴两 侧 3’黏性末端: 3’末端比5’长 5’黏性末端: 5’末端比3’长 成平齐末端: 切割位点在识别序列中心轴处 ※切割位点标识: ↓、/;※同位酶、同裂酶与同尾酶 同位酶: 同裂酶: 起源不一样, 但有相同识别序列, 切割DNA后产生相同末端一组限制 酶 同尾酶: 起源不一样, 识别序列也不一样, 但切 割DNA后产生相同末端一组限制酶;酶活影响原因 DNA纯度: 杂质会降低酶活 DNA甲基化: DNA甲基化后稳定, 不易切割 DNA分子结构: 线性DNA易切, 超螺旋难切; CG多难切 星活性: 酶特异性改变而展现活性;缓冲液: 时间与温度: t=1-1.5h;T=37OC 反应体积与甘油浓度: 保留时50%甘油防冻 融, 反应时50%; 酶体积在总反应体积1/10 以内, 防酶活被抑制; 反应体积: 20-100ul ※酶活单位定义: ;;※三种限制酶;三 DNA连接酶;分类 T4DNA连接酶: 可连接双链DNA片段平齐末 端、黏性末端 大肠杆菌DNA连接酶: NAD+供能, 只连接黏性 末端;反应条件: T: 16oC原因: 温度37OC最宜, 但温度过高会氢键断裂 缓冲液: Tris-HCl50-100mmol/L维持pH稳定 MgCl2: 10mmol/L, 激活剂 ATP: 0.5-1 PTT: 5mmol/L, 巯基试剂, 防被氧化 pH: 7.5 V: 10-20uL t: 4-16h ※酶活单位: 1IU=最适条件下, 15oC反应1h, 完全连接 1ugλDNA所需酶量;四 DNA聚合酶（DNAPol）;分类 大肠杆菌DNAPolⅠ: 三活性: 5’→3’聚合, 3’→5’外切, 5’→3’外切 ※ 3’→5’外切: 校正 5’→3’外切: 切除突变DNA、引物 反应条件: ;应用: 缺口平移制探针、 3’-粘端末端标识 合成cDNA第二链;※切口移位法标识DNA;※3’-粘端末端标识;Klenow: 定义: DNAPolⅠ被木瓜蛋白酶水解成2/3大 亚基 酶活: 5’→3’聚合, 3’→5’外切 应用: 随机引物标识核酸探针、5’-粘端补平 或3’端标识、合成cDNA第二链、DNA 序列分析、3’-端末端标识;T4DNAPol: 定义: T4噬菌体中发觉, 可标识平齐末端 DNA聚合酶 两活性: 5’→3’聚合, 3’→5’外切（对单链DNA 作用更强） 基因工程中作用: 平齐末端标识, 3’末端 隐蔽;T7DNAPol: 特点: 连续合成能力最强 酶活: 5’→3’聚合, 3’→5’外切 应用: 引物延伸、双脱氧终止法对长DNA测序;反转录酶: 基础知识: 见分子生物学, 以RNA为模板, 生 成无内含子cDNA 分类: AMV-逆转录酶: Mo-MLV-逆转录酶: 应用: ;TaqDNAPol: 耐高温: 最适温度75℃~80℃, 95℃可维持活 性40min—用于PCR 无3’→5’外切校正活性: PCR循环次数太多会 造成DNA损伤积累 激活剂: Mg2+, 低浓度Mn2+中也有活性 抑制剂: Ca2+;反应条件 Tris-HCl: 维持pH7