基因工程概论.pptVIP

化学合成法基础战略 全基因合成 化学合成目基因前提条件是基因DNA序列已知, 有三种战略: 小片段粘接法: 混合退火 依据目基因全序列, 分别合成12-15碱基长单链DNA小片段。 T4-DNA连接酶连接 克隆入适宜载体 补钉延长法: 混合退火 依据目基因两条互补链全序列, 分别合成12-15碱基长单链DNA小片段以及20-30碱基长单链DNA中片段。 T4-DNA连接酶连接 克隆入适宜载体 Klenow酶聚合 化学合成法基础战略 全基因合成 大片段酶促法: 混合退火 依据目基因全序列, 分别合成40-50碱基长单链DNA片段。 T4-DNA连接酶连接 克隆入适宜载体 Klenow酶聚合 化学合成法基础战略 全基因合成 上述三种方法各有利弊: 化学合成DNA单片段愈短, 收率就愈高, 但因为化学合成份额较大, 成本较高; 在大片段酶促法合成目基因时, 即使化学合成份额相对较小, 成本较低, 但大片段化学合成收率极低, 比如, 每聚合一个单体产物收率为95%则合成50个碱基长DNA单链大片段总收率只有7.7%。 化学合成法基础战略 全基因合成 化学合成法基础战略 探针等寡聚核苷酸合成 在一些情况下, 往往只知道目基因编码产物部分氨基酸序列 而基因序列未知, 此时需要从已知氨基酸序列推测为其编码DNA 序列, 然后合成探针, 筛选由鸟枪法或cDNA法得到重组子, 最终 取得含有目基因目重组子。因为大多数氨基酸拥有简并密码子 故在探针序列设计时必需考虑下列问题: 生物体对简并密码子偏爱性, 合成系列探针 探针应含有足够长度, 通常在17-20个核苷酸之间 探针内部不应出现可能互补区域 化学合成法基础战略 探针等寡聚核苷酸合成 某段连续氨基酸序列: Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile 全部可能DNA序列: TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T GATG G G T T C CGA CGG CGT CGC 设计简并探针序列: TGTATGGACGAIATGA TGTATGGATGAIATGA TGCATGGACGAIATGA TGCATGGATGAIATGA A G 另外还能够参考多种生物体EST数据库进行倾向性简并序列设计。 expressed sequence tag 化学合成单元操作 化学合成DNA实质是根据序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去, 每接一个单体就是一个循环反应, 包含: 基团保护、分离、缩 从反应机理上来讲, DNA化学合成方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法; 具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐, 基础上已淘汰; 后者反应中间物分离程序较简 合、分离、去保护五大操作单元。 便, DNA合成仪就是依据固相亚磷酸液三酯法原理设计。 化学合成单元操作 O H G H H H H O CH 2 O DMT P O Me N CH Me Me CH Me Me H DMT: 二甲氧基三苯甲基 激活 缩合 氧化 脱替换基 玻璃珠 连接臂 DNA化学合成用途 合整天然基因 修饰改造基因 设计新型基因 制备探针、引物、接头 如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素 如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等。 基因等。 E 基因文库构建 4 目基因克隆与基因文库构建 基因文库基础概念 基因文库构建程序 基因组文库重组克隆排序 文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！ 文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！ 基因工程概论 4 目基因克隆与基因文库构建 基因工程或DNA重组技术三大用途前提条件是从生物体基因组中克隆目基因。目基因取得以后, 或确定其表示调控机制及生物学功效, 或建立高效表示系统, 构建含有经济价值基因工程菌（细胞）, 或将目基因在体外进行必需结构功效修饰, 然后输回细胞内改良生物体遗传性状, 包含人体基因诊疗。 通常来说, 目基因克隆战略分为两大类: 一类是构建感爱好生物个体基因文库, 立即某生物体全基因组分段克隆, 然后建立适宜筛选模型从基因组文库