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文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！ 基因分析技术简介 在生物、医学、农牧业领域应用 测序应用 基因组DNA测序 cDNA测序 未知序列测序 已知序列再测序 双脱氧链终止法原理 　　Sanger双脱氧链终止法最大特点是引入了双脱氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂。 　　ddNTP能够在DNA聚合酶作用下和多核苷酸链3ˊ羟基形成磷酸二酯键, 但却不能再与下一个核苷酸缩合, 结果使得多核苷酸链延伸终止。 双脱氧链终止法测序关键步骤 扩增待测DNA片段, 使其变性, 取得单链DNA模板。 选择一条与DNA单链互补短链引物, 将引物用放射性同位素标识。 引物先同单链模板复性。 在四个反应管中分别加入待测DNA单链模板、互补引物分子、四种dNTP、DNA聚合酶(Klenow 酶)以及不一样ddNTP进行聚合反应。 双脱氧链终止法测序与PCR区分 ? 测序只用一条引物, PCR需要两条引物 ? 测序产物线性增加, PCR产物指数增加 ? 测序需要dNTP和ddNTP , PCR只用dNTP ? 测序产物是一系列长度相差一个碱基片段, PCR产物只有一条带 1、商品化测序试剂盒 - 荧光染料标识 ABI PRISM BigDye v3.1和v1.1试剂盒 2、自动化测序仪 ABI PRISM 310、3100和3730全自动遗传分析仪 双脱氧链终止法发展 BigDye v3.1试剂盒反应体系及条件 反应体系: 　单链DNA模板 引物 DNA聚合酶 　Mg2+ 4种dNTP(dATP,dGTP,dCTP和dTTP) 4种不一样荧光标识ddNTP (ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP) 循环条件: 96℃ 1min →(96℃ 10s →50℃ 5s → 60℃ 4min)× 25个循环 → 4℃保温 ABI Prism 310 Genetic Analyzer capillary Syringe with polymer solution Autosampler tray Outlet buffer + Injection electrode - Inlet buffer Autosampler Tray Sample Vials Electrode Capillary See Technology section for more information on CE 电进样及电泳 荧光激发和检测 影响测序质量原因 测序成功前提: PCR本身是成功 PCR产物一定要经过纯化后再测序 测序引物比PCR引物靠后部分(Nested primers) 在测序反应过程中反应体积不要有波动（蒸发） 选择适宜测序产物纯化方法 SNP筛查 　　单核苷酸多态(SNP)是基因组中最为丰富遗传多态, 是决定个体差异最关键遗传基础。 　　多态形式关键包含单碱基替换、插入或缺失, 通常也包含微小片断插入/缺失。 　　因为很多SNP位点本身就是功效多态位点, 使得SNP在疾病易感基因相关性研究中有着广泛应用。 SNaPshot? Multiplex System SNaPshot 试剂盒反应体系及条件 反应体系: 　单链DNA模板 引物 DNA聚合酶 　Mg2+ 4种不一样荧光标识ddNTP 循环条件: (96 ℃ 10 sec → 50 ℃ 5 sec → 60 ℃ 30 sec) × 25循环 → 4℃保温 方法特点 分型正确: 该技术也称小测序技术, 其正确度仅亚于直接测序。 多位点同时检测: 能够同时检测达12个位点, 而Taqman一次仅能检测一个。 不受样本量限制:而Taqman对少许样本不适合。 注意事项 1． 同一反应管中, 不一样位点引物长度必需不一样, 最好能相差4-6个碱基。 2． 引物与模板互补部分（有效引物）Tm值最少要50℃ 。 3． 为了改变引物长度, 区分不一样位点, 能够在引物5’端加poly(dT)、poly(dA)、poly(dC)或者poly(dGACT)尾巴。这四种尾巴理论上不轻易形成二级结构, 而且都经过试验验证。小心: poly(dT)有可能与真核基因3’端poly(dA)尾巴互补。 4． 在引物设计时候, 假如+链DNA序列不理想, 难以设计出最好引物, 请使用-链DNA设