第五章病原细菌PPT课件.ppt

第一代Bt杀虫剂的缺点： 杀虫蛋白类型比较单一、杀虫谱较窄：虽然发现Bt可以杀死节肢动物门昆虫纲中的鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目等，还可以杀死线形动物门、扁形动物门、原生动物门等，但就某一个菌株或亚种来说，它的杀虫谱还是比较窄，使用对象主要限于鳞翅目害虫。 毒蛋白晶体易分解：受自然环境影响，特别经紫外线照射极易分解破坏，田间杀虫效果通常仅能维持3～4天。 Bt的基因工程 Bt基因工程微生物的构建 抗虫转Bt基因植物 Bt 工程微生物 广谱Bt工程菌的构建 高效表达Bt工程菌的构建 延长持效期工程菌的构建 延缓抗性Bt工程菌的构建 多功能Bt工程菌的构建 (1)??? 质粒的接合转移 为了增强Bt的杀虫范围，可消除毒蛋白表达水平较低的质粒而保留表达水平较高的质粒，或将不同亚种、不同菌株中的质粒通过接合作用加以复合。 美国Ecogen公司1991年注册的生物杀虫制品Foilo F的有效成分EG2424。 EG2424在孢子形成期产生cryⅢA和cryⅠA(c)蛋白，形成菱形和双金字塔形晶体，对玉米螟与马铃薯甲虫害虫均有杀伤作用，已应用到土豆、茄子及其它农作物的生物防治中 。 广谱Bt工程菌的构建 cryIIIA cryIA(c) cryIIIA cryIIIA cryIA(c) EG2424 (Foilo F) Bt. kurstaki HD-263-8 Bt. morrison EG2158 （2） 杀虫蛋白基因的体外重组 重组DNA技术的迅速发展，为构建新Bt工程菌提供了更大的灵活性。 许多杀虫蛋白基因不能通过接合作用进入一个新的受体细胞，因为并不是每一种质粒都可以通过接合进行转移。另外，对于几种昆虫特异的ICPs可能定位在同一质粒上。 Crickmore等（1990〕将对鞘翅目昆虫有效的拟步行甲亚种tenibrionis亚种的毒蛋白基因cryIIIA导入对双翅目有效的isreal亚种，新菌株不仅对鞘翅目以及双翅目蚊幼虫有毒外，还产生了一种新的杀虫活性，对鳞翅目的菜青虫也具有一定的杀虫活性。 Gamel and Piot把鞘翅目特异的cryIII基因利用载体导入Bt subsp. kurstaki，转基因菌株不仅表达了高水平的鞘翅目杀虫活性，而且保持了对鳞翅目昆虫的杀伤作用。 高效表达Bt工程菌的构建 （1）在无芽孢 (Spo-) 或经消除 (或部分消除) 质粒的受体菌中表达ICP基因 cry1、cry2和cry11类基因是依赖于芽孢形成的ICP基因，它们的表达受到芽孢形成过程的调控。 cry3A是一类不依赖于芽孢形成过程的ICP基因。Cry3A蛋白在无芽孢的菌株中的产生量是野生菌株的2.5倍。 通过质粒消除使菌株的毒力得以提高。 （2）增加ICPs基因拷贝数 基因拷贝数对表达量的影响 将cry3Aa基因连接于在细胞中有15个拷贝的载体上的表达量，明显高于仅4个拷贝的载体的表达量。 （3）增加ICP基因的稳定性 质粒的不稳定性，外源质粒DNA对宿主DNA的影响。 Kalman等 运用转化与转导相结合的方法将cry1C基因经HD-73整合到库斯塔克亚种菌株的染色体上，结果表明，所得到的工程菌株中cry1C基因能高效表达，同时稳定性增加。 （4）对启动子结构加以改造 对ICP基因启动子区域的改变，有可能是提高ICP基因表达量的一种有效方法。 沉默基因的表达 表达载体 （5）利用辅助蛋白的增效作用 27kDa、20kDa (P20)蛋白质能显著增加杀虫蛋白基因的表达量，在Bt中对cytA表达及晶体形成具有增强作用。 利用辅助蛋白的增效作用，可以构建高效表达工程菌。 延长持效期工程菌的构建 1991年Mycogen公司利用生物囊 (biopacking) 技术将Bt毒蛋白基因转化荧光假单胞菌，经发酵使工程菌大量产生毒蛋白，再采用加热与浸碘工艺将菌体细胞杀死，灭活的菌体细胞壁便形成一种微囊将毒蛋白包裹其中研制了一种Cellcap包囊系统，由于形成了包囊毒蛋白的有效保护包囊，延缓了Bt毒蛋白降解，杀虫持效提高了2～3倍。 M-One，M-Trak，MVP等系列产品 三、苏云金芽孢杆菌 苏云金芽孢杆菌：（Bacillus thuringiensis, Bt）分布广泛，革兰氏阳性，芽孢杆菌。 1901年，石渡（S. Ishiwata）从患病的家蚕幼虫分离得到。 猝倒杆菌 Bacillus sotto Bt猝倒亚种 1911年Berliner从德国苏云金地区谷仓中患病的地中海粉螟幼虫体内分离到类似的细菌。 1915年才正式命名为 Bacillus thuringiensis。 此后分离出与苏云金杆菌类似的产生