临床检验仪器与技术试验指导(电泳+PCR).pdfVIP

实验一 PCR基因扩增 一、实验目的与要求 （1）掌握 PCR反应的基本原理； （2）了解 PCR的基本操作流程。 二、实验原理 聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系 统，其原理类似 DNA分子的天然复制过程，是将在待扩增的 DNA 片段和与其两 侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后， DNA 扩增 2n 倍。该技术已成为分子生物学中一种有助于 DNA 克隆及基因分析的必需工具。 PCR的工作程序实际上是一个在模板 DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和 四种脱氧核苷酸等存在的情况下， DNA 聚合酶依赖的酶促合成反应。 扩增的特异 性取决于引物与模板 DNA 的结合。整个扩增过程分三步：①变性，加热使模板 DNA 双链间的氢键断裂而形成两条单链；②退火，突然降低温度后模板 DNA 引 物按碱基配对原则互补结合， 也存在两条模板链之间的结合， 但由于引物的高浓 度、结构简单等特点，主要的结合发生在引物与模板之间；③延伸，在 DNA 聚 合酶及镁离子等的存在条件下，从引物的 3 ′端开始，结合单核苷酸，形成与模 板链互补的新的 DNA 链。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中 的 DNA 量就增加一倍， 新形成的 DNA 链又成为下一轮循环的模板。 经过 25～40 6 9 个循环后， DNA 可扩增 10 ～10 倍。 1. 缓冲液： 10～50 mMTris- HCl (pH8.4)：维持 Taq酶作用环境的偏碱性。 25～50 mMKCl：促进引物退火， 50 mM 会抑制 Taq 酶的活性。 100 μg / ml 牛血清白蛋白 (BSA)：对酶有一定的保护性， 如质量不好将起相 反的作用，建议使用乙酰化的 BSA。明胶、 Tween-20、二硫苏糖醇 (DTT) 也有 类似作用。 2. dNTPs : dATP、dGTP、dCTP、dTTP——底物， dNTP 的质量与浓度和 PCR扩增效率有 密切关系。 0.02～0.2 mM，尤其是注意 4 种 dNTP 的浓度要相等，如其中任何一种浓度 不同于其它几种时，就会引起错配。 dNTPs可与 Mg2+结合，应注意 Mg2+浓度与 dNTPs浓度之间的关系， Mg2+ 浓度比 dNTPs 浓度高 0.2～2.5 mM 。 过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。 过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。 保存： dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH或 1M Tris-HCl 的缓冲液将其 pH 调节到 7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使 dNTP 降解。 3. MgCl ：1.5～2.0 mM 2 Taq 酶具有 Mg2+依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，在一 般的 PCR反应中， 各种 NTP浓度为 200umol/L 时，Mg2+浓度为 1.5～2.0 mmol/L 为宜 过量：增加非特异扩增并影响产率， 过低：则酶活性显著下降。 4. 引物 (Primer-P)：0.2～1 μM 预扩增核酸片段两端的已知序列，是 PCR特异性反应的关键 PCR产物的特异性取决于引物与模板