分子生物学常用技术简化版.pptVIP

三、我们能用 PCR 做什么？ 自 PCR 技术创立以来，经近 20 年的发展，在基本 PCR 技术基础上产生了多种 PCR 的衍生技术，应用于各种不同的目的 基因克隆或亚克隆－－基因工程 特定基因表达量的分析 基因突变的检测－－基因诊断 病原体特征性序列的鉴定－－基因诊断 定点诱变－－第 4 节 DNA 序列测定－－第 3 节　 第六十一页，共96页 最常用的 PCR 是 RT-PCR RT-PCR：reverse transcription PCR 以 mRNA 为模板 先进行逆转录，再进行 PCR 为什么要以 mRNA 为模板？ mRNA 无内含子，克隆的基因可在原核表达 mRNA 的量代表了基因的表达水平 第六十二页，共96页 如何利用 RT-PCR 检测基因表达水平? 定量 PCR(quantitative PCR) PCR 产物的量与起始的模板量有关 利用 PCR 对模板 DNA 或 cDNA 进行定量测定 定量 PCR 一般用于特定基因 mRNA 水平的检测 RT-PCR 可用于基因表达水平检测 需设定内部参照物(reference gene)，如：GAPDH、actin、18s rRNA 等稳定表达基因 定量是相对的，一般是不准确的 第六十三页，共96页 为什么说 RT-PCR 定量是不准确的？ 指数扩增期，产物量与模板量成正比 进入平台期，产物量不能再反