分子生物学实验复习答案.docVIP

分子生物学实验复习答案 实验一:DNA的制备 1、 为什么分子生物学实验时需要注意EB污染, 答:溴化乙锭(EB)可以嵌入碱基分子中，导致错配，故为强诱变剂，具有高致癌性。由于溴化乙锭具 有一定的毒性，实验结束后，应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人 体健康。 2、 DNA加样缓冲液的用途, 答:1.增加样品密度以保证RNA或DNA沉入加样孔内; 2.使样品带有颜色便于简化上样过程; 3.其中的染料在电场中可以预测的泳动速度向阳极迁移 3、 DNA电泳时所用的琼脂糖凝胶，其浓度是如何决定的, 答:一个给定大小的线性DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移 率的对数与凝胶浓度成反平行线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kbde DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%，大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%。 4、 琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理, 答:核酸分子是两性解离分子，DNA分子在高于其等电点的PH溶液中带负电荷，在pH值为8.0-8.3时， 核酸分子中碱基几乎不解离，而磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电场中向正极移动。DNA分 子在电场中通过凝胶介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与DNA分子大小及 构象有关，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。对于线性DNA分子，其电场中的迁移率与 其分子量的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比 较，便可测出未知片段的大小。 5、 琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的,为什么, 答:核酸染色剂。有EB和Gold View两种，都属于荧光染料，可以嵌入到核酸双链的两碱基对之间， 形成一种荧光络合物,在紫外光的激发下，发出荧光。 6、 制备基因组DNA时用到的以下试剂分别起什么作用, 答:1、CTAB:分离缓冲液，溶解DNA。是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合 物，在高盐溶液中(0.7mol/LNaCl)是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl) 时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。 2、氯仿:有变性作用，抽提取出蛋白质的污染。 3、无水乙醇:洗去一些盐离子和CTAB 。 4、75%乙醇:沉淀DNA ，使DNA与CTAB分离 实验二:RNA的制备 1、 制备RNA时通常要注意什么,为什么, 答:1、RNA极易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中 要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性。 ?、操作过程中应始终戴一次性手套，并经常更换，以防止收、臂上的细菌和真菌以及人体自身分 泌的RNA酶带到试管或污染工具 ?、避免在操作过程中说话聊天 ?、所有玻璃器皿均应在使用前于180度的高温下烘烤6H或更长时间。 ?、配置的溶液应尽可能用0.1%DEPC在37度处理12h以上，然后用高压灭菌锅出去残留的DEPC。 2、DEPC有致癌的潜在现已，操作时要小心，一定要戴手套，最好在通风橱中进行，RNase AwayTM 试剂可以代替DEPC，操作简单，价格低，且无毒性。 2、 制备的RNA通常有那些用途,DNA呢, 答: 3、 RNA制备好后是通过什么方法检测其是否降解的,从胶上检测什么指标来判断RNA质量好坏,为什 么, 答:是否降解:1.2%琼脂糖凝胶电泳。在紫外检测仪下观察，完整的总RNA样品应呈现三条带:28S、 18S、和5S rRNA。其中28S rRNA条带的亮度应该为18SrRNA条带的1.5~2倍。反之，说明部分 28S rRNA已经降解成18S rRNA。若无清晰条带，则说明样品RNA已严重降解。若加样孔内或孔 附近有荧光区带，则说明有DNA污染。 质量鉴定:检测RNA溶液的吸光度。280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景 (溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280(Ratio，R)。1.82.0 时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为 缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2(一般应该是2.2的)。当R1.8时，溶液中蛋白或者时 其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R2.2时，说明RNA 已经水解成单核酸了。 4、 RNA制备好后通过什么方法测定其含量, 答:紫外光吸收法。核算在260nm的电磁波下