PCR分子诊断技术PPT课件.pptx

PCR分子诊断技术;内容;PCR技术的概念及发展简史;;PCR反应的基本成分;?脱氧核甘三磷酸（dNTP） 标准PCR反应体系中包含4种等物质的量浓度的脱氧核甘三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。 ?二价阳离子 所有的热稳定DNA聚合酶都要求有游离的二价阳离子，常用的是Mg2＋，Mn2+ ?缓冲液 维持PCR反应体系中的PH，使用Tris－Cl缓冲液。 ?一价阳离子 标准的PCR缓冲液中包含50mmol／L的KCl，有益于DNA片段的扩增。 ;PCR的基本反应原理和特点;; 重复上述变性－退火－???伸的循环过程，每一循环获得的“半保留半复制”链继续成为下次循环的模板。通常一个完整的循环时间需要2-4min，2-3h就能将靶核酸放大几百万倍。 一般临床扩增目的核酸将循环次数设定在40-50个循环之间，以此达到扩增目的。 ;PCR的特点 ?特异性高 包括：引物的特异性及延伸时，碱基配对的正确性；Taq DNA聚合酶的稳定性。 ?灵敏度高 PCR扩增产物的量以指数方式增长，能在2-3h内，将1个靶分子DNA扩增至10亿个分子，因此一个反应体系中如有2-3个靶分子，则可成功检测出目的基因。 ?简便快速 通过PCR技术可在2-4小时之内获得目的基因，为临床患者提供快速准确的确诊检测。 ;实时荧光定量PCR法;实时荧光定量PCR法荧光阈值和循环阈值;;PCR技术的临床应用、意义及发展趋向;PCR临床意义： ? 快速确诊是否有病毒、细菌等致病性微生物感染； ?了解体内感染的数量、复制程度，是否具有传染性； ?对临床治疗的用药监测，有无好转或耐药情况，如产生耐药，如何指导用药种类及计量等。 PCR的发展趋势 随着临床分子生物学的不断发展，DNA测序技术已逐渐成熟，可为临床疾病的分子诊断提供更精确的判定依据，现由一代测序技术已发展至三代测序技术，为医疗领域带来更方便、快捷的检测手段。 ;临床PCR检验的实验室管理;PCR实验室的布局设计;临床PCR检验标本的采集、运送;标本运送及保存 核酸为DNA的标本在室温下建议8h内送至实验室检测，2-8可保存3d；RNA的标本4h内送至实验室检测，如不能及时检测应立即分离血清－20℃存放（1-2周）。分泌物室温下8h内送检，如不能及时检测，应使用生理盐水洗涤处理后保留沉淀于－80℃保存。检测完毕的阳性标本应分离血清至－80℃冰箱存放。 ;PCR核酸检测的工作流程;扩增区 将提取好的核酸扩增反应物加盖密封好后放置于相应的核酸扩增仪中，设置好该批实验的模板后进行核酸扩增反应。在扩增结束后，运用仪器软件分析出扩增产物的浓度值。 产物分析区 此区域一般用于基因突变、分型检测的反向点杂交实验中，将核酸扩增产物加入已固定多种探针的硝酸纤维素膜或尼龙膜中，将样本中与膜条上同源序列的探针结合，再经显色后得到基因序列。 以上两个区域是PCR实验室污染较为严重的区域，因此应每次在实验结束后应对仪器、操作台等物品进行紫外灯照射及消毒液（10％的次氯酸钠、75%的酒精）擦拭，以助于扩增产物的降解。;PCR污染的产生及预防措施;污染的监测与预防措施 ?加样器：对污染的加样器进行及时处理，并使用一次性含有滤芯的吸头，同时对吸头及反应管进行高压灭菌后再行使用。 ?试剂的配制存放：严防试剂配制过程中产生的污染、配制好的试剂必须与标本、扩增产物分开存放。 ?操作手法：严格按照PCR实验操作要求及预防污染的原则进行核酸提取。 ?设立空白及阴、阳性对照：每批试验。 ;实时荧光PCR扩增仪简介;3.特点：多色荧光检测（FAM、SYBR Green I、VIC／JOE、TAMRA和ROX多种荧光染料）；实时数据监控，并有熔点曲线实时分析；96个样品孔采用卤钨灯作为光源，稳定但寿命短。 4.仪器使用的注意事项：放置水平、有稳定的电压并连接地线（配备UPS不间断电源）、保证正常运行的室温温度不超过15-25，仪器要放置在通风、散热较好的区域，远离水源、火源、有腐蚀性物质及磁场感染等环境影响。 ;5.仪器的维护与保养：在日常实验结束，仪器冷却后对仪器表面进行正常维护及保养工作；使用中应小心热盖与反应槽的污染，并定期使用95%的乙醇进行擦拭，如被污染严重应先使用中性消毒液进行处理；每年应要求仪器厂家对仪器的光学部分、温控部分、ROI及背景进行荧光强度的校正。 ;临床PCR检验的质量保证;PCR实验室质量管理体系的建立;?作业指导书：实验室日常工作的指导性文件，一般分为管理、仪器、项目三大类，内容包括检验目的、