mRNA差别显示技术 .pptxVIP

mRNA差别显示技术;主要内容; 高等生物大约有3~5 万个不同的基因,在每一个正常的体细胞中都含有相同的基因组拷贝,但在不同的组织细胞中仅有10%~20%的少部分基因被选择性表达,这种选择性表达是在发育过程中细胞分化的根本原因,是调控细胞生命活动过程的核心机制。因此,比较不同组织之间,或相同组织在不同生理条件下,或胚胎在不同的发育时期的基因表达差异,可分离并克隆出这些特异性表达的基因。近年来,该领域的研究取得了特别大进展, 扣除杂交(subtractive hybridization, SH)、基因芯片技术(DNA chip technique)、基因表达的系统分析(serial analysis of gene expression, SAGE)、噬菌体全套抗体库技术(phage display antibody repertoire library technique)和双向电泳技术(two-dimensional gel electrophoresis)先后成功地建立。; 基因表达调控的一种方式。指在对信号或诱导物做出应答时,选择表达不同的基因,或使基因的表达水平有所不同。;DD的发明及其基础;二、基本概念; 反转录PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)又称为逆转录PCR。其原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采纳Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品分析成为估计。该技术主要用于:分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 RT- PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)即逆转录PCR,是将RNA的逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应(PCR)相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞/组织中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直截了当克隆特定基因的cDNA序列等。 ;RNA指纹;水稻品种DNA指纹;基本原理; 基本原理是,几乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端,都带有一个多聚的腺苷酸结构,即通常所说的poly(A)尾巴。因此,在RNA聚合酶的作用下,可按mRNA为模板,以oligo(dT)为引物合成出cDNA拷贝。依照mRNA分子3’-末端序列末端结构的分析能够看到,在这段poly(A)序列起点碱基之前的一个碱基,除了为A的情况之外,只能有C、G、T三种估计。依照这种序列结构特征,P、 Peng等人设计合成三种不同的下游引物,它由11个或12个连续的脱氧核苷酸加上一个3’-末端锚定脱氧核苷酸组成,用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示,如此每一种此类人工合成的寡核苷酸引物都将能够把总mRNA群体的1/3分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。因此,采纳这三种引物,能够将整个mRNA群体在cDNA水平上分成三个亚群体。然后用一个上游的随机引物和与反转录时相同的oligo(dT)引物对这个ｃＤＮＡ亚群体进行ＰＣＲ扩增,因为这个上游的引物将随机结合在cDNA上 ,因此来自不同ｍＲＮＡ的扩增产物的大小是不同的,能够在测序胶上明显分辨开来,从而筛选出不同样品间基因差异表达的DNA片段。;;(1) 提取总RNA,在这个步骤中注意不能有DNA污染,一般用无RNA酶的DNA酶在37℃下处理30 min; (2)在逆转录酶作用下,以Oligo T11MN 为引物(M为G、A、C中的任一种,N为A、C、G、T任一种),进行逆转录; (3)PCR反应,扩增cDNA的第一条链; (4)扩增后的cDNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,使差异表达的cDNA片段在6%测序胶上分开; (5)找出不同处理间差异显示的条带,从胶上切割下来,并回收,再进行第二次扩增; (6)克隆差异片段,差异片段可作为探针; (7)Northern 杂交,验证目的片段,去掉假阳性片段; (8)对目的片段进行测序; (9)以克隆的目的片段为探针,从基因组文库中筛选出相应的全长基因。;mRNA差异显示技术简略流程图 ;放射性自显影技术;DD的优点 ;DD的缺点 ;(１)用无ＲＮＡ酶的ＤＮＡ酶处理总ＲＮＡ,防止ＤＮＡ污染。 (２)使用Ｔａｇ酶时,批号应相同,不要经常调换。 (３)ＰＣＲ循环次数减至３０次,提高退火温度,减少非特异性条带。 (４)把从测序胶上切下来的条带纯化后分成两部分,一部分用于克隆,另一部分用作探针杂交以筛选克隆。 (５)改变引物