Southern杂交及拷贝数检测 .docxVIP

PAGE PAGE 1 Southern杂交及拷贝数检测 1．植物总DNA提取 植物总DNA的提取办法无数，但从原理上看主要有两种：CTAB法及SDS法。(1) CTAB法：十六烷基三乙基溴化铵(cetyl-triethyl ammonium bromide, CTAB)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol/L NaCI)是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3mol/L NaCl)时，CTAB与核酸的复合物在溶液中沉淀，通过离心就可将其同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入使核酸沉淀(CTAB能溶解于)。(2) SDS法：其原理是利用高浓度的SDS，在较高温度65℃条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采纳提高盐浓度及降低温度的做法使蛋白质及多糖杂质沉淀(最常用的是加入5mol/L的KAc于冰上保温，在低温条件下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物)，离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚／氯仿抽提，反复抽提后用沉淀DNA。DNA提取的详细办法参见相关技术操作手册。2．植物DNA样品纯度及浓度的检测Southern杂交的植物DNA样品在纯度、长度及浓度上均应达到一定的要求。纯度上应无蛋白质、RNA,多糖及抑制限制性酶切的杂质，并无提取时所用的试剂，如酚及盐离子的残留。在长度上不应低于50kb，浓度应为0.3～1ug/uL，所以提取的DNA在用于酶切前必需检测其纯度及浓度。目前主要采纳琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法举行检测。(1)琼脂糖凝胶电泳检测：制备0.8％琼脂糖凝胶，取适量的被检DNA样品及分子质量标准DNA同时电泳，电泳后于紫外光下检测，所提植物DNA应展现出一条分子质量较大的清楚条带，其迁移率应小于分子质量标准样品λDNA/Hind Ⅱ中23kb条带的迁移率。假如所提DNA样品条带展现长带弥散状，则表白提取过程中DNA已严峻降解。假如在溴酚蓝处浮现光明的荧光区，则表白样品中含有较多的RNA，可用RNase消化去除。假如在梳孔内有荧光浮现，则可能是由于样品中DNA未彻低溶解或浓度过高，或样品不纯导致大量带正电荷的杂质与DNA样品结合。至于样品浓度，对于清楚的条带，可通过与标准DNA样品的荧光亮度相比较来估量。例如，用法单一分子质量标准DNA的浓度为0.5ug/uL，点样量为2uL，则DNA量为1ug。亮度与其相同的条带，DNA量大致相同。(2)紫外分光光度法测定：纯净的DNA溶液是透亮?????的，用紫外分光光度计测定其260nm及280nm的汲取值比值应为1.8, 260nm及230nm的汲取值比值应大于2.0。若OD260 /OD280大于1.8，表白样品中含有较多的RNA，这时应当用RNase重新处理样品，若比值小于1.6，则解释样品中蛋白质杂质较多或混杂有提取时所用的酚试剂。这时需要用氯仿重新抽提样品进一步去除蛋白质杂质及酚。当OD260/OD230小于2.0时，表白溶液中有残存的小分子及盐类杂质。可用70％反复洗涤DNA沉淀。DNA样品纯化后，应按照其在260nm的汲取值，确定样品的DNA浓度。50ug/mL的双链DNA对260nm紫外光的汲取值为1.0。凡是浓度大于0.25ug/mL的纯净DNA样品均基本符合此关系，测定OD260值即可确定DNA样品浓度。3．植物DNA样品的保存按照所测的样品DNA浓度，用无菌1×TE将样品稀释或浓缩成0. 5～1. 0mg/mL的浓度。高分子质量的DNA溶液在4℃条件下可储存数周，近期用法时不必举行低温冷冻，需要长久储存时，可置-20℃冷冻，但冷冻样品从冰箱中取出时必需立刻置于碎冰上，令其缓慢解冻，以防止DNA分子断裂。为防止溶液溶化时引起的DNA断裂，也可以将DNA样品以沉淀的形式保存在-20℃。4．杂交探针的制备探针是指经特别化合物标志的特定的序列。用于Southern杂交的探针有DNA探针和RNA探针。按照探针有否发射性又可将探针分为发射性探针及非发射性探针，按照标志物参入部位的状况探针又分为匀称标志探针及末端标志探针。用于检测植物基因组中外源基因整合的探针应为同源探针，普通认为探针长度在300个以上时杂交效果较好，染色体上基因定位的探针应较长，可达2000bp，用于组织细胞内原位杂交的探针应具有较好的组织穿透性及较高的特异性，这时探针长度可短至几十个核苷酸。杂交探针制备包括探针核苷酸序列的猎取及探针标志两大部分内容，下面分离举行介绍。1)探针核苷酸序列的猎取鉴定转基因植株应用法外源基因做探针。探针核苷酸序列普通从工程菌质粒或中间质粒上切取，短的几十个核苷酸的序列可用人工合成寡核苷酸探针的办法合成，甚至可用PCR扩