MTT法检测细胞存活和生长 .docxVIP

PAGE PAGE 1 MTT法检测细胞存活和生长 体外细胞培养理论和相关技术的完美和成熟，极大加速了当代药物研发的进程，从药物早期设计、筛选到药理活性、机制讨论，都离不开体外细胞试验。其中，考察药物对培养细胞增殖影响的试验，是药物开发过程中最基础、应用最广泛的试验办法，其试验结果挺直打算了药物的下一步研发方向。目前，试验室常用MTT法和有丝分裂指数法考察药物对培养细胞增殖的影响，办法简便易行，可用于大规模的药物筛选试验，广泛应用于药物研发特殊是抗肿瘤药物的研发过程中。值得注重的是，两者都基于药物孵育后活细胞的相对数量以反映药物对培养细胞增殖的影响，只能用来检测细胞相对数和相对活力，而无法考察凋亡细胞的数量，在试验设计过程中应当注重。 一、MTT法［原理和目的］MIT法是一种检测细胞存活和生长的办法，是药理学试验中常用的考察药物对培养细胞增殖影响的试验办法，基于活细胞对MTT生物转化产物的吸光度，采纳比色法反映活细胞数量。由于敏捷度高、检测办法容易、经济、迅速，该办法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性实验以及肿瘤发射敏感性测定等。MTT化学名为3-(4,5一）-3,5-二苯基四氮唑溴盐［3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-di-phenytetrazoliumromide]，商品名为噻唑蓝，是一种黄色彩的染料。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲攒( formazan )，并沉积在细胞中，而死细胞则无此功能，由此区别细胞活性。在一定细胞数范围内，形成的甲攒量与活细胞数成正比。细胞中的甲臜能溶解在( dimethyl sulfoxide,DMSO）等有机溶剂中，通过测定其光汲取值，可间接反映活细胞数量。MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞肯定数。【材料】1．状态良好的人结肠癌细胞系Caco-2（贴壁细胞）和人白血病细胞系K562悬浮细胞）。2．试剂、、培养基（DMEM或RPMI 1640培养粉）、双抗。MTT干粉、DMSO,SDS、、浓盐酸、D-Hanks液（每1000m1含NaCl 8.00g, KC1 0.40g, NaH2P04.H20 0.06g,NaHC03 0.35 g)、PBS液（每l000ml含NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HP04·12H20 2.86g，KH2P040.2g) ,75％。3．仪器净化工作台、C02孵箱、倒置显微镜、细胞计数板、0.22um微孔滤膜滤器、铝箔、96孔板、平板离心机、酶标仪。【办法】1. MTT溶液的配制 MTT具有致癌性，操作时须戴手套。囫囵过程应避光操作，容器用铝箔小包或用法不透亮?????及褐色容器。称取MTT干粉50mg，溶于10m1 PBS或生理盐水中，60℃水浴或超声助溶，终浓度为5 mg/ml。彻低溶解后，用法0.22um微孔滤膜滤器过滤除菌，1.5m1 EP管分装，-20℃避光冻存待用。可长时光保存，避开反复冻融，当MTT溶液变为灰绿色时不能再用。2．甲臜溶解液的预备 DMSO能够溶解甲臜，无需配制，用法便利，溶解速度快，适用于贴壁细胞。但对人体毒性较大，且需吸除原培养液，在此过程中，可能会损失部分甲臜结晶，导致结果不稳定。用法三联液（SDS-异丁醇-盐酸）溶解甲攒，可挺直加入原培养液中，贴壁细胞和悬浮细胞都能用法。但是，需要提前配制，且溶解速度慢。三联液的配制：称取SDS 10g，5ml,10M HCl 0.lml，用双蒸水溶解配成100m1溶液，搅拌匀称后高压灭菌2小时，常温放置。3．铺板对贴壁细胞，例如Caco-2细胞，挑选状态良好、汇集度达80％左右的细胞单层，弃去培养液，用法D-Hanks液轻柔的清洗三次以除去表面杂物，胰酶消化后，新奇培养液吹打匀称。对悬浮细胞，例如K562细胞，挑选对数期细胞悬液，500～1000r/min离心5分钟，弃去培养液，新奇培养液吹打匀称。取制备的细胞悬液，锥虫蓝染色计数，调节细胞悬液浓度为104～105/ml。取96孔板，每孔加入100ul细胞悬液。对于生长快速的癌细胞，接种密度为4000/孔即可。96孔板边缘的36个孔，因为培养时孔内水分蒸发显然，不建议用法；同时，向孔内加入无菌的PBS可削减板内部各孔的水分挥发。此外，应预留调零孔，加入不含细胞的培养液100ul。铺板完成后，置37℃,5% CO2的孵箱中培养过夜，使细胞贴壁。对于悬浮细胞，铺板后可挺直举行下一步。4．加药用法不含血清的培养液配制梯度浓度的试药溶液，首次试验时，浓度区间应尽可能大或参考文献。取出96孔板，加入不同浓度的药液20ul，每个浓度设3～6个复孔。对比孔