PCR的反应条件 模板.docxVIP

PAGE PAGE 1 PCR的反应条件 PCR反应条件为温度、时光和循环次数。 温度与时光的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性一退火一延长3个温度点。在标准反应中，采纳三温度点法，双链DNA在90-95℃变性，再快速冷却至40-60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后迅速升温至70-75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延长。对于较短靶基因（长度为100-300bp时）可采纳二温度点法，除变性温度外、退火与延长温度可合二为一，普通采纳94℃变性，65℃左右退火与延长（此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性）。1) 变性温度与时光：变性温度低，解链不彻低是导致PCR失败的最主要缘由。普通状况下，93℃-94℃ , 1 min，足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延伸时光。但温度不能过高，由于高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物彻低变性，就会导致PCR失败。2）退火（复性）温度与时光：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度迅速冷却至40℃-60℃，可使引物和模板发生结合。因为模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时光，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50％的引物，55℃挑选为最适退火温度的起点较抱负。可通过以下公式协助挑选合适的变性温度：TM值（解链温度）=4 (G＋C) +2 (A+T)；复性温度＝Tm值一（5-10℃)。在Tm值允许范围内，挑选较高的复性温度可大大削减引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时光普通为30-60sec，足以使引物与模板之间彻低结合。3) 延长温度与时光：Taq DNA聚合酶的生物学活性一－70-80℃150核苷酸／S/酶分子；70℃ 60核苷酸／S/酶分子；55℃ 24核苷酸／S/酶分子；高于90℃时，DNA合成几乎不能举行。PCR反应的延长温度普通挑选在70-75℃之间，常用温度为72℃，过高的延长温度不利于引物和模板的结合。PCR延长反应的时光，可按照待扩增片段的长度而定，普通 lkb以内的DNA片段，延长时光1 min是足够的。3 - 4kb的靶序列需3-4min；扩增l0kb需延长15 min。延长时光过长会导致非特异性扩增带的浮现。对低浓度模板的扩增，延长时光要稍长些。4）循环次数：循环次数打算PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。普通的循环次数选在30-40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。