反相高效液相色谱法测定尿液4种肾病标志物.docVIP

反相高效液相色谱法测定尿液4种肾病标志物 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：反相高效液相色谱法测定尿液4种肾病标志物 1 1材料和方法 2 文2：反相高效液相色谱法测定康溃丸中芍药苷含量 5 1 仪器与试药 6 2 方法与结果 6 3 讨论 8 参考文摘引言： 8 原创性声明（模板） 9 文章致谢（模板） 9 正文 反相高效液相色谱法测定尿液4种肾病标志物 文1：反相高效液相色谱法测定尿液4种肾病标志物 0引言 糖尿病并发肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病患者致死的重要原因之一，已引起了人们的广泛关注. 非蛋白氮代谢产物如肌酸(creatine, Cr)、肌酐(creatinine, Cn)、尿素(urea, U)和尿酸(uric acid, Ua)即是与DN相关的几种物质. 已报道的有关这些物质的分离分析方法主要有比色法［1］、酶法［2］、液相色谱法［3-6］、毛细管电泳法［7-9］等. 其中比色法和酶法通常只能测定单一的物质，而且尿液中的一些内源性物质对测定有干扰；液相色谱法则多集中在对某一种或部分物质的测定上；毛细管电泳测定这些标志物重现性有待于提高. 我们运用反相高效液相色谱法，对DN患者尿液中与DN相关的Cr, Cn, U和Ua这4种非蛋白氮代谢产物进行同时分离检测. 同时测定尿液中的4种物质目前还未见报道. 此法具有快速、灵敏度高和重现性好的特点，完全可运用于临床上患者尿液的日常分析和早期肾病的监测. 1材料和方法 材料Agilent 1100液相色谱仪（美国Agilent公司）；Cr，Cn，Ua均购自Sigma公司（USA，Sigma）；甲醇为色谱纯试剂（天津第二化学试剂厂）；其余试剂均为分析纯，水为二次重蒸水. 方法 色谱条件色谱柱为Agilent C18柱（200 mm× mm,内径5 μm），流动相含体积比为30%的甲醇和10 mmol/L，pH 的磷酸缓冲溶液，等度洗脱，流速 mL/min，检测波长200 nm，柱温为室温，进样量为10 μL. 标准溶液的配置和尿样的处理方法Cr, Cn和U标准溶液均使用二次重蒸水配置成一定的浓度. Ua溶液的配置方法如下：取30 mg磷酸钾，溶解在40 mL重蒸水中，加热至60℃，使其完全溶解，精确称取Ua 28 mg,溶解于热磷酸钾溶液中，冷却至室温，移入100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，贮存在棕色瓶中保存. 尿液样品的处理方法：取新鲜的尿液用水稀释1倍后待用. 所有溶液每周更换1次，使用前均过 μm的水相膜后再用于色谱分析. 2结果 色谱条件的优化固定其它色谱条件不变，分别改变缓冲液的pH值、流动相（pH ）中甲醇比例、流动相中缓冲液浓度和流动相的流速，考察了其对4种物质分离的影响. 四种物质的分离随pH、甲醇比例、磷酸缓冲液浓度和流动相的流速的变化情况分别如图1，2所示. A：流动相pH；B：甲醇比例. 图1流动相pH和甲醇比例对几种标志物保留时间的影响（略） A：磷酸缓冲液浓度；B：流速. R12: U和Cr之间的分离度; R23: Cr和Ua之间的分离度; R34: Ua和Cn之间的分离度. 图2流动相中磷酸缓冲液浓度以及流速对分离的影响（略） 方法重现性在选定的色谱条件下，连续5次测定了同一样品，对各物质的迁移时间、峰面积和峰高的重现性进行了考察，结果表明,各物质的迁移时间的变化很小（保留时间的D值见表1），方法的重现性较好. 定量标准曲线、回收率以及最低检测限配置一系列浓度的标准溶液，按上述色谱条件进行分析测定，将所测的峰面积对物质的浓度作回归分析，其线性相关系数均大于；以信噪比(S/N)为3来测定检测限；添加已知量标样，测定其含量， 计算 方法的回收率(表1) 表1方法的相关参数（略） 样品分析在选定的色谱条件下，对标准溶液和实际DN尿样进行了分析，5 min内4种物质即可达到完全分离，分离结果如图3所示，实际DN尿样中的4种物质得到了很好的检出，尿样里的其他物质对分析无干扰. 采用此法对某糖尿病患者以及正常人尿样中的Cn, Cr, U，Ua分别进行测定，结果糖尿病患者尿样中Cn, Cr, U，Ua的含量分别为, , ， μmol/mL, 正常人尿样中的Cn, U，Ua的含量分别为, ， μmol/mL,而Cr未被检出. 图3标准溶液(A)和尿样(B)的色谱图（略） 3讨论 对分离的影响其从图1A中可以看出，在pH ~范围内U和Cr的出峰时间和顺序几乎不随pH的变化而变化；而对于Cn和Ua来说，其出峰时间和顺序都随pH的变化而变化，当pH接近时，两者的出峰时间近乎相同，得不到分离. 因此，在选择最佳pH时，主要考虑Cn和