凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量PowerPoint.pptxVIP

凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量;实验目的;实验原理;凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子那么排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出???，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得别离。假设分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，那么居二者之间从柱中流出。总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以别离开来。 ; 如果假定蛋白质分子近于球形，同时没有显著的水合作用，那么不同大小分子量的蛋白质，在洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量的关系。在一根凝胶柱中，凝胶颗粒间空隙所含水相体积为外水体积VＯ，不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为时VＯ，出现洗脱峰。 　　 凝胶颗粒内部孔穴的总体积为内水体积Vi，能全部渗入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为VＯ+Vi时，出现洗脱峰。 利用Andrews的实验经验式： lgMr = a/b—Ve/bVo 式中，Ve为洗脱体积。它是自加样品开始到该组分的洗脱峰〔峰顶〕出现时所流出的体积。Vo为外水体积，Mr为相对分子质量，a和b为常数。 葡聚糖凝胶有不同的型号，用于别离不同相对分子质量大小的物质。例如Sephardex G-75的分级范围是3000-80000的球形分子。在本实验中用于别离胰岛素〔Mr为6000〕和牛血清蛋白〔Mr75000〕。;6;仪器和试剂;实验步骤 ;2. 装柱与平衡 装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出，将层析柱垂直装好。关闭出口，向柱管内参加约1/3柱容积的洗脱液，然后在搅拌下，将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉降约2—3cm后，翻开柱的出口，调节适宜的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。装柱要求连续、均匀、无气泡、无“纹路〞。 将洗脱剂与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱相连。通过2—3倍柱床容积的洗脱液使柱床平衡，然后在凝胶外表上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。 ;3. 上样与洗脱 样品上柱是实验成败的关键之一，假设样品稀释或上柱不均，会使区带扩散，影响层析效果。上样时应尽量保持床面的稳定。先翻开柱的出口，待柱中洗脱液流至距床外表1～2mm时，关闭出口，用滴管将1ml样品慢慢地加至柱床外表，应防止将床面凝胶冲起，翻开出口并开始计算流出体积，当样品滲入床中接近床外表1mm时关闭出口。按加样操作，用少量〔约1ml〕洗脱液冲洗管壁2次。最后参加少量洗脱液于凝胶上，使高出床外表3～5cm，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒流泵，调好流速，以每管3ml/10min流速开始洗脱。上样的体积，分析用量为柱床容积的1—2%；制备用量为柱床容积的20%~30%。;4. 收集与鉴定 用自动局部收集器收集流出液，每管4ml，紫外检测仪280nm波长处检测，最高的一个OD值时的体积即为吸收峰的洗脱体积Ve。 5．凝胶柱的处理 凝胶用过后，反复用蒸馏水洗后保存，如果有颜色或比较脏，可用0.5mol/LNaCl洗涤。短期可保存在水相中，参加防腐剂或加热灭菌后于低温保存。建议长期用枯燥状态保存。;计算 ;本卷须知;思考题 ;9、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。7月-217月-21Sunday, July 11, 2021 10、低头要有勇气，抬头要有低气。11:57:2011:57:2011:577/11/2021 11:57:20 AM 11、人总是珍惜为得到。7月-2111:57:2011:57Jul-2111-Jul-21 12、人乱于心，不宽余请。11:57:2011:57:2011:57Sunday, July 11, 2021 13、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。7月-217月-2111:57:2011:57:20July 11, 2021 14、抱最大的希望，作最大的努力。11 七月 202111:57:20 上午11:57:207月-21 15、一个人炫耀什么，说明他内心缺少