大黄素增强结肠近端平滑肌细胞钙离子依赖氯离子通道的表达.docVIP

大黄素增强结肠近端平滑肌细胞钙离子依赖氯离子通道的表达 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：大黄素增强结肠近端平滑肌细胞钙离子依赖氯离子通道的表达 1 1 材料与方法 2 2 结果 4 3 讨论 5 文2：CCKBRmRNA在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达 6 1 材料与仪器 7 2 方法 7 3 结果 9 4 讨论 10 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 13 正文 大黄素增强结肠近端平滑肌细胞钙离子依赖氯离子通道的表达 文1：大黄素增强结肠近端平滑肌细胞钙离子依赖氯离子通道的表达 大黄素(emodin) 是大黄(Rhubarb)有效成分蒽醌类衍生物之一，已被证实可增强肠道蠕动，促进平滑肌细胞的收缩活动［1,2］。钙离子依赖氯离子通道(Ca2+activated Cl- channels, ClCa Channel)是平滑肌组织中非常重要的，与收缩密切相关的离子通道。而大黄素对ClCa通道的作用，国内外未见相关报道。本研究利用全细胞膜片钳和相对定量的单细胞RTPCR等技术研究大黄素对大鼠近端结肠ClCa通道以及基因表达的影响，进一步探讨大黄素促结肠动力作用机制。 1 材料与方法 11 标本制备健康成年清洁级豚鼠，250～300g，雌雄不拘，卒击枕部至昏，断颈放干血液，剖腹取6cm 左右长的近端结肠，迅速放入充以95 % O2 和5 % CO2的混合气的Tyrode 液中，沿肠系膜纵行剪开，将去黏膜的组织剪成宽3 mm、长15 mm 的结肠带肌条和环行平滑肌肌条。制备单个平滑肌细胞［2］时，将肌条剪松置于消化液中，37 ℃下轻微振荡孵育20～30 min，用Ca2+free PSS液洗5次，然后组织块用广口火抛光的吸管吹打，产生细胞悬液。所有肌条（包括酶消化的肌条）备用时均保存于2～8℃的KB液中。 12 肌条实验取一肌条固定于浴槽中，可自由收缩的一端用丝线与等长传感器相连。用含钙Tyrode液灌流标本，充以95 % O2 和5 % CO2 的混合气，pH为 ，灌流速度3 ml·min-1，温度37℃±℃。待标本出现 规律 的自发节律性收缩并稳定30min后，记录正常状态下电和收缩活动的指标，然后分别以含有5μM、10 μM、20 μM、40 μM和80 μM等不同浓度大黄素（或添加氯离子通道拮抗剂）的含钙Tyrode 液灌流，记录药物对收缩活动的影响。肌条收缩活动的测量采用等长传感器将机械收缩转换为电信号，输出的信号在RM6200 型四导生理记录仪上绘出。肌张力表示为曲线下至绝对基线之间的平均面积（g）。位相性收缩基线规定为所检测的位相性收缩之前10s内的水平线，位相性收缩的幅度为收缩曲线与位相性收缩基线之间的平均面积（g） 13 单个平滑肌细胞收缩的测量［3］酶消化的肌条使用前用广口火抛光的吸管吹打成细胞悬液，取约1~2ml细胞悬液置于倒置显微镜的灌流槽底部的盖玻片上。将细胞外液换为Ca2+PSS，应用显微影像输出系统将图像输出到 计算 机中，用图像分析系统软件分析30个平滑肌细胞的收缩活动。观察不同浓度大黄素对平滑肌细胞收缩的作用，收缩活性表示为细胞长度缩短的百分数。 14 平滑肌细胞的RTPCR用酶分离方法［4］分离单个细胞检测结肠平滑肌细胞ClCa 家族基因（ClCa1, 2, 3 and 4）mRNA的表达。.在细胞贴附倒盖玻片上后，在相差显微镜下，通过广口火抛光的硅玻璃电极负压吸引将平滑肌细胞吸入电极内，然后将电极内容物注入 ml EP管，收集60个平滑肌细胞。所有的细胞在液氮中速冻，-80℃冰箱中保存。将去粘膜平滑肌条在含5% BSA 的37℃大黄素或Tyrode液中孵育20min，观察大黄素对ClCa通道基因mRNA表达的影响。孵育后的肌条用以上的方法分离、收集并保存40个平滑肌细胞。TRIzol(Gibco)提取总RNA，Revert Aid TM Fit Strand cDNA合成试剂盒（K1621 Fermentask, life sciences）合成cDNA，并进行PCR扩增。取2μg RNAs 进行两次PCR扩增，每次35个循环。ClCa1, 2, 3 and 4和βactin的引物用设计，在上海生工合成。引物的基因名称、氨基酸序列、产物长度和基因号见表1。 表1 所检测ClCa基因名称及其引物和产物列表（略） 然后10 μl的PCR产物在% agarose gel上进行变性电泳，用ethidium bromide标记。Gel Doc XR 系统(BioRad, Hercules, 中国 )分析和定量产物的荧光强度。目