VP22融合型显性负性突变体抑制乙肝病毒复制.docVIP

VP22融合型显性负性突变体抑制乙肝病毒复制 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：VP22融合型显性负性突变体抑制乙肝病毒复制 1 1材料和方法 2 文2：前S1蛋白与乙肝病毒复制及HBV 8 2　前S1蛋白在乙肝和非乙肝疾病中的阳性率 9 4　前S1蛋白与E系统的关系 9 5　前S1与ALT的关系 10 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 12 正文 VP22融合型显性负性突变体抑制乙肝病毒复制 文1：VP22融合型显性负性突变体抑制乙肝病毒复制 0引言 全球目前有亿慢性乙型肝炎病毒（hepatitis virus B, HBV）感染者，每年约有100万人死于HBV感染的相关疾病，占疾病死因的第9位［1］. 目前，国际上尚无有效 治疗 慢性乙肝的手段. 基因治疗技术的不断 发展 为抗HBV治疗提供了新的思路和途径. 其中显性负性(dominant negative，DN)突变体的胞内表达是HBV基因治疗的重要策略之一［2-6］. Elliott等［7］发现，单纯疱疹病毒1(herpes simplex virus type 1, HSV1)的结构蛋白VP22(及其融合蛋白)可从培养基进入细胞内，并可不经过细胞细胞接触依赖性在同型或异型细胞之间转移. 我们将HBV核心蛋白(HBV core protein, HBc)与VP22进行融合构成DN突变体，以期利用VP22的蛋白转导特性进一步提高DN突变体的抗病毒效应. 1材料和方法 材料质粒pVP22/mycHis2和(-)为Invitrogen公司产品；EBOHBV克隆有倍HBV全长基因组为本室保存. 限制性内切酶、连接酶购自TaKaRa Biotech ；鼠抗HBc抗体和鼠抗cmyc抗体为SantaCruz公司产品，FITC标记的羊抗鼠IgG为武汉博士德生物工程有限公司产品；DMEM培养基、进口胎牛血清以及LipofectinMine2000购于GIBCO公司；固相放免定量分析HBsAg试剂盒为北京北免东雅生物技术研究所产品；其余化学试剂均为国产分析纯. 方法 寡核苷酸合成所有寡核苷酸的合成均由TaKaRa Biotech Co. Ltd完成. 下划线部分是为便于分子克隆操作而引入的限制性内切酶的识别序列，大写碱基为起始码或终止码. HBc1: 5′gcgcggtaccATGgacatcgaccctt3′ (KpnI)；HBc2:5′gcgcctcgagTCAggatccacattgaggttccc3′ (XhoI, BamHI)；US: 5′gcccggatccatgacctctcgctccgtg3′(BamHI)；UR: 5′ccccagatctatcgggactcgccatacc3′ (BglII)；DS: 5′gccgagatctgacgcggccacggcg3′ (BglII)；DR: 5′gggcctcgagTTAcagctaatcctcttctgag3′ (XhoI)；cmyc1: 5′gcccggatccgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgTAActcgaggggc3′(BamHI, XhoI)；cmyc2: 5′gggcctcgagTTAcagatcctcttctgagatgagtttttgttcggatccgccc3′(XhoI, BamHI) 细胞培养细胞整合有完整的HBV基因组，能持续转录和翻译HBV基因，产生HBsAg, HBeAg和Dane颗粒，由第四军医大学唐都 医院 传染科惠赠. 细胞在含有15 mL/L胎牛血清的DMEM培养基(含有终浓度为200 mg/L的G418)，37℃, 50 mL/L CO2条件下进行培养，2 d换液1次，6 d传代1次. 载体构建本实验构建的载体主要有以下几种. pHBc： 以载体EBOHBV为模板，HBc1和HBc2为引物扩增HBc编码序列. PCR产物经KpnI/XhoI酶切后克隆入(-)，构成载体pHBc. ① pHVP22/M： 将合成的cmyc1和cmyc2均调至浓度为 mmol/L，取等体积混匀，于100℃煮沸5 min并缓慢冷却至室温退火形成双链. 双链cmyc片段经BamHI/XhoI酶切后连入经相同酶切的pHBc质粒，形成pHVP22/M. ② pHVP22/F： 质粒pVP22/mycHis2为模板，US/DR为引物扩增VP22编码序列全长及cmyc表位. PCR产物经BamHI/XhoI酶切后连入经相同酶切的pHBc质粒，形成pHVP22/F. ③ pHVP22/U： BamHI单酶切质粒pHVP22/M并进行脱磷酸化处理. 以pVP22/my