用积分法考察黄嘌呤对Candidaspecies尿酸酶的抑制作用.docVIP

用积分法考察黄嘌呤对Candidaspecies尿酸酶的抑制作用 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：用积分法考察黄嘌呤对Candidaspecies尿酸酶的抑制作用 1 1材料和方法 2 文2：用积分法考察黄嘌呤对Candidaspecies尿酸酶的抑制作用 5 1材料和方法 6 参考文摘引言： 8 原创性声明（模板） 10 文章致谢（模板） 10 正文 用积分法考察黄嘌呤对Candidaspecies尿酸酶的抑制作用 文1：用积分法考察黄嘌呤对Candidaspecies尿酸酶的抑制作用 0引言 酶抑制剂是新药开发热点. 通常据表观米氏常数（apparent MichaelisMenten cotant, Kmapp）和表观最大反应速度（apparent maximal reaction rate, Vmapp）随抑制剂浓度变化同步确定抑制类型和抑制常数（inhibition cotant, Ki）筛选抑制剂［1］. 双倒数法测定Kmapp和Vmapp筛选抑制剂需要底物浓度分布在米氏常数(MichaelisMenten cotant, Km)两侧，且范围应尽量宽. 此法测定动力学参数对低浓度底物下初速度误差和底物浓度本身的误差都非常敏感，用于筛选抑制剂的成本也很高. 用积分速度方程酶反应曲线，即积分法，可同步确定Km和最大反应速度(maximal reaction rate, Vm). 经典积分法所用积分速度方程自变量缺乏统计合理性，所得参数可靠性低［2］. 最近发现用以反应时间为自变量的积分速度方程拟合酶反应曲线，能可靠测定酶动力学参数并筛选抑制剂［3-7］. 此积分法筛选抑制剂对初始底物浓度误差不敏感，且效率高而成本低. 我们用此积分法考察黄嘌呤对Candida species尿酸酶的抑制作用，以期进一步明确此法筛选抑制剂的可靠性和应用条件. 1材料和方法 材料 尿酸、黄嘌呤购自ICN, Candida species尿酸酶( )购自Sigma ［U 0880］. 其余试剂为国产分析纯. 方法 缓冲液含100 μmol/L二乙基三氨基五乙酸［6,7］. 反应体系含 mL缓冲液，底物、抑制剂和酶液共 mL. 用双倒数法分析时，酶为 μkat/L，记录反应延迟30 s后反应1 min内的数据. 积分法分析时，酶为 μkat/L，初始底物浓度为55 μmol/L，在(25±)℃以10 s间隔记录启动反应40 s后底物消耗到1/8 Kmapp(双倒数法测定)的反应曲线. 用线性回归确定双倒数法所得参数. 积分法测定参数按以前方法分析启动反应40 s后光吸收变化的6个以上数据［7］. 用Visual Basic 编写程序，数据记录成文件读入，作图鉴别畸异值，结果输出到指定文件. 线性回归分析Kmapp及1/Vmapp随抑制剂浓度的变化确定对应的抑制常数. 根据两种抑制常数的统计有效性和相对大小确定抑制类型［8］ 统计学处理： 结果用x±s表示，用SAS 分折数据，P为有统计学差异. 2结果 双倒数法分析无抑制剂时9～70 μmol/L底物下初速度得Km为（±）μmol/L (n=3). 用积分法分析起点为40 μmol/L而终点接近 μmol/L反应曲线得Km为（±）μmol/L (n=8). 两种方法无差异（P）. 反应初始阶段畸异值对积分法结果影响很小，但在底物浓度降低到接近Km时即使的光吸收偏差可导致Km的偏差达20％. 升高终点底物浓度常造成Km负偏差，降低起点底物浓度造成正偏差. 如被分析数据中没有明显畸异值，起点底物浓度在双倒数法所得Km的2倍以上，终点底物浓度在1/6 Km以下波动时积分法所得Km变化15％，而Vm的变化常10%. 如终点底物浓度 μmol/L，起始底物40 μmol/L时所得Km变异和偏差也接近20％. 如起始底物浓度远Km，则剩余底物浓度 黄嘌呤为18 μmol/L时双倒数法所得Kmapp30 μmol/L. 用黄嘌呤升高Kmapp后积分法对畸异值的敏感性显著降低. 如起始底物浓度双倒数法所得Kmapp的倍，获得与双倒数法偏差20％的Kmapp所需剩余底物浓度与黄嘌呤浓度正相关. 固定起始底物浓度为40 μmol/L，在5 μmol/L黄嘌呤时需终点底物浓度 μmol/L，13 μmol/L黄嘌呤时需终点底物浓度 μmol/L，18 μmol/L黄嘌呤时需终点底物浓度 μmol/L，所得Kmapp偏差才可15％. 分析起始底物浓度接近40 μmol/L而终点底物浓度接近 μmol/L的反应曲线，积分法所得Kmapp与双倒数法一致，且与抑制剂浓度成正比. 据Kmapp的变化，积分法得Ki为（±）μmol/L (