人硒蛋白PcDNA探针的制备及其在肝脏组织中的表达.docVIP

人硒蛋白PcDNA探针的制备及其在肝脏组织中的表达 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：人硒蛋白PcDNA探针的制备及其在肝脏组织中的表达 1 1材料和方法 2 文2：硒蛋白P在结肠癌组织中的表达及其意义 6 1对象和方法 6 参考文摘引言： 9 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 11 正文 人硒蛋白PcDNA探针的制备及其在肝脏组织中的表达 文1：人硒蛋白PcDNA探针的制备及其在肝脏组织中的表达 0引言 硒是人体必需的微量元素之一，参与GSHPx的合成，具有抗氧化损伤作用［1］，流行病学调查表明缺硒可导致恶性肿瘤的发生［2］. 实验证实食物中添加硒可以减少前列腺癌、结肠癌、肺癌及肝癌的发生［3］. 硒的许多生物学功能是通过硒蛋白来实现的，迄今已经发现了18种具有生物功能的硒蛋白，硒蛋白P（Selenoprotein P，SeP）是其中一种［4］. 人体几乎所有的组织中都含有SeP，近年来大量研究证实其与多种恶性肿瘤有关，已经成为研究的热点. 但从基因水平对肝癌组织中的SeP进行原位检测，目前尚少见报道. 因此我们制备了特异性的SeP cDNA探针，对正常肝脏、肝硬化、肝癌组织进行核酸原位杂交，检测其表达水平，探讨SeP与肝脏疾病特别是肝癌发生发展的关系. 1材料和方法 材料质粒PBluescriptHuman Selenoprotein P由美国Georgia大学惠赠，全长为 kb，为氨苄青霉素抗性（Amp+），宿主菌为JM109. 小量质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司. Taq DNA聚合酶购自华美生物工程公司. DNA Marker购自大连Takara公司. 地高辛标记和检测试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司. 13例正常肝脏标本取自非肝脏疾病的尸检患者及肝移植的供肝者，30例肝硬化及30例原发性肝细胞肝癌（HCC）标本取自西安 交通 大学第一 医院 1999/2001间手术切除标本，肝硬化和HCC均经病理诊断证实. 所有标本经40 g#12539;L-1甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm连续切片. HE染色复查切片. 方法 质粒的转化质粒PBluescriptHuman Selenoprotein P冷点在保鲜膜上，将剪碎的膜用20 μL的TrisHCl缓冲液（TE pH ）浸泡30 min，浸出液加入100 μL JM109感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min，42℃热休克90 s，迅速置于冰上2 min，加入800 μL LB培养基，37℃温浴45 min，5000 r#12539;min-1离心5 min，留100 μL上清混匀沉淀，涂布于已加入Amp（100 μg#12539;mL-1）的LB琼脂平板上，37℃培养过夜. 质粒的扩增和提取挑取琼脂平板上的单一菌落，接种于5 mL含Amp（100 μg#12539;mL-1）的LB培养基中，37℃摇床，100～150 r#12539;min-1，8～12 h. 以质粒提取试剂盒按说明提取质粒. 取5 μL进行2 g#12539;L-1的琼脂糖凝胶电泳检验质粒提取结果. 置于-20℃冰箱保存备用. cDNA探针的制备与标记根据SeP基因序列（GenBank access number：36425）使用Primer Premier软件（Veion ，PREMIER Biosoft Inc）设计鉴定引物. 上游引物5′CTCCATCGCCTCATTACCAT3′，下游引物5′GAGGCAAACGTCACTGACAA3′，扩增片段长度为447 bp（542~988）. 引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，稀释浓度 25 μmol#12539;L-1. 以提取的质粒为模板，50 μL反应体系中含有模板RNA 4 μL，Taq DNA聚合酶（3 U#12539;μL-1，华美生物工程公司） μL，引物各2 μL，10×PCR Buffer（MgCl2Free） 5 μL，MgCl2（25 mmol#12539;L-1） 2 μL，4×dNTP（ mmol#12539;L-1） 4 μL，灭菌去离子水 μL. 循环参数为94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃延伸7 min. 取5 μL行2 g#12539;L-1琼脂糖凝胶电泳检验扩增结果， 标准分子量marker为DL2000＋15 000 DNA marker. 以PCR产物纯化试剂盒按说明纯化PCR产物，乙醇沉淀法浓缩. 用地高辛标记和检测试剂盒（德国Boehringer Mannheim）标记探针并进行检