结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达质粒的构建及表达医学.docVIP

结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达质粒的构建及表达医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达质粒的构建及表达医学 1 1材料和方法 2 文2：IL18PE38真核表达质粒的构建及表达医学 6 1 材料和方法 6 2 结果 8 3 讨论 9 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 12 正文 结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达质粒的构建及表达医学 文1：结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达质粒的构建及表达医学 0引言 结核病是目前危害全球人类健康的重要传染病. 这主要是因为① 卡介苗（BCG）对成年人结核病的预防效果不稳定，保护力为0%~70%；② 没有特异性的诊断试剂；③ 艾滋病等免疫缺陷个体的出现加快了本病的严重后果；④ 耐药菌株的大量出现［1］. 因而寻找更有效的替代卡介苗的疫苗已成为当务之急. Rv2389蛋白是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB) 复活促进因子（resuscitationpromoting factor, Rpf）样蛋白家族的一员，序列分析发现，它不仅与细菌的增殖有关，还有可能是宿主免疫系统识别的一个靶抗原［2］. 为此，我们在Rv2389原核表达和纯化的基础上，构建了真核表达载体并在CHO( 中国 仓鼠卵巢)细胞中进行表达，同时从其表达水平和基因转录两方面进行鉴定，为其功能研究奠定基础. 1材料和方法 材料MTB H37Rv菌株,P815细胞由本室保存；真核表达载体(-)由本室保存；含有Rv2389基因的重组质粒pPro EX HTRv2389由本室构建保存；Rv2389蛋白多抗由本实验室制备；AMV，RNA 酶抑制剂和TRIzol（Promega公司）；限制性内切酶、T4 DNA连接酶和核酸分子质量标准品（宝泰克公司）；质粒提取试剂盒（Omega公司）；梭华soft阳离子聚合物（厦门太阳马公司）；羊抗鼠荧光抗体（宝信公司） 方法 基因片段的扩增与测序结核分枝杆菌Rv2389全基因序列的特异性引物序列为：P1：5′gga tcc gcc acc atg acc ccg ggt ttg ctt ac3′，含BamHⅠ酶切位点，起始码和cozak序列；P2：5′ccg aag ctt atc gtc cct gct ccc cga tga3′，含HindⅢ酶切位点和终止码. PCR反应条件：94℃ 40 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环，72℃延伸10 min. 回收PCR产物，用T4连接酶将PCR产物与pGEMTeasy载体连接，转化 DH5α，随机挑取5个克隆提取质粒进行双酶切鉴定，取2个鉴定正确的克隆进行测序［3］ 重组质粒的构建及鉴定将测序正确的Rv2389基因克隆至真核表达载体(-)，构建重组质粒pCDNARv2389. 连接转化、质粒提取均按 文献 进行［3］. 以BamHⅠ和HindⅢ酶切pCDNARv2389，10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒. 细胞转染将5×105 个CHO细胞接种于6孔板，细胞数量达孔底约2/3时进行转染. 转染前用不含抗生素的1640培养液洗2次，以 mL 1640培养液重悬细胞. pCDNARv2389重组质粒10 μL和阳离子聚合物5 μL各用80 μL无血清的1640培养液稀释，两者混匀后室温作用20 min，缓慢加入到细胞中. 培养24 h后收集细胞，同时设正常细胞对照. 检测mRNA表达收集重组质粒转染的CHO细胞，2000 min离心10 min. 参照Gibco的TRIzol试剂盒说明书提取细胞mRNA. 在上述10 μL mRNA 溶液中，加入1 μL Oligo(dT)12-18引物，70℃水浴5 min后立即置于冰上，加10×buffer 4 μL， MgSO4 4 μL， 10 mmol/L dNTPs 2 μL，RNA inhibitor μL，AMV μL，H2O μL. 混匀，42℃作用1 h，70℃ 15 min终止反应. PCR反应时加入cDNA第1链2 μL，反应条件为94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸40 s，共进行30个循环，末次循环72℃延伸2 min，扩增产物以10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测. 间接免疫荧光检测目的基因表达将转染pCDNARv2389质粒的CHO细胞爬片，用纯化的Rv2389融合蛋白制备的免疫血清作为一抗，间接免疫荧光法检测CHO细胞中融合蛋白的表达［4］ 2结果 目的基因的扩增、克隆及酶切鉴定用PCR方法从H37Rv中扩增出Rv2