脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响.docVIP

脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响 1 1材料和方法 2 四环素荧光标记 4 2．3PEMFs对rMSCs增殖水平的影响 5 四环素荧光标记 5 文2：玻璃粘连蛋白对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化影响 7 1 材料和方法 8 2 结 果 10 3 讨 论 10 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 13 正文 脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响 文1：脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响 0引言 骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）存在于骨髓基质系统中，具有自我更新能力和多向分化潜能，免疫原性弱［1-3］. 脉冲电磁场（pulsed electromagnetic fields，PEMFs) 能够促进活细胞增殖及分化，刺激骨局部因子的产生，改善骨密度和生物力学特性［4］，用于骨折延迟愈合、骨不连、骨质疏松症等骨科疾病［5］. 近年来，国内学者在这方面开始了大量研究工作，认为MSCs经12 Hz， mT的PEMFs合理刺激后，细胞增殖加速，符合成骨细胞的形态特征和生物学特性［6］. 利用恒磁场作用于骨组织中细胞，发现恒磁场处理可以促进MSCs向成骨方向分化［7］. 本实验通过观察rMSCs在低频率PEMFs的作用下增殖水平变化和细胞分化情况，以了解不同参数的PEMFs对rMSCs产生的影响. 1材料和方法 材料 SD仔鼠，12～15 d，体质量30～35 g，第四军医大学实验动物中心提供. 骨愈合刺激仪（第四军医大学生物医学工程系研制，）， 治疗 频率为15 Hz和1 Hz. 低糖DMEM（美国Hyclone公司）；胎牛血清（天津灏洋生物制品科技有限责任公司）；胰蛋白酶，茜素红S（美国Sigma公司）；盐酸四环素胶囊（西安利君制药股份有限公司）；碱性磷酸酶试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司） 方法 的体外分离培养 断颈处死大鼠，无菌条件下取其股骨和肱骨. 在PBS中将骨剪成1～2 mm3的小块，100目筛网过滤后移入离心管中，1200 rpm离心5 min，弃上清，重悬浮于4 mL低糖DMEM中. 72 h后换液. 生物学特性鉴定 进行PAS过碘酸雪夫氏染色、油红O染色和碱性磷酸酶（ALP）染色. 生长曲线的绘制 将原代细胞以5×106 cells/孔接种在24孔板上，第4日开始，每日消化3个孔，分别计数，求平均值绘制生长曲线. 将第3代细胞以1×104 cells/孔接种在24孔板上，第2日开始以同上方法绘制生长曲线. 刺激方法 PEMFs发生仪频率：15 Hz，1 Hz；磁感应强度：0～ mT可调；线圈直径：200 mm. 调整两线圈距离至100 mm. 将线圈放置在孵箱中，刺激时将细胞放置在两线圈中间位置. 调整需要的强度和频率，刺激结束后，将对照组放在同样位置相同时间. 刺激时间为每次3 h，1次/d. 法检测 细胞增殖将rMSCs以1×104 cells/mL接种于7个96孔板中，每板接种32孔. 刺激方式为：T0组(对照组)；T1组(15 Hz， mT)；T2组(15 Hz， mT)；T3组(15 Hz， mT)；T4组(1 Hz， mT)；T5组(1 Hz， mT)；T6组(1 Hz， mT)，连续作用5 d. 接种第2日开始PEMFs作用. 第3日每板选择16孔，加MTT（5 g/L）20 μL，37℃孵育4 h，弃上清，加入DMSO 150 μL，振荡10 min，测定490 nm波长时各孔的吸光度A值. 第5日对其余孔做同样检测. 活性检测 将rMSCs以每孔1×104 cells/mL接种于6个24孔板中，每板接种8孔，分为2组，每组3个板. 刺激方式为：T0组(对照组)，T1组(1 Hz， mT). 接种第2日开始PEMFs刺激，连续刺激15 d. 第3日选两个板，测定ALP活性. 第5日和第15日各检测2个板. 四环素荧光标记 将rMSCs以3×104 cells/mL接种于2个6孔板中，分为对照组与实验组. 第2日开始对实验组进行PEMFs刺激，每天刺激结束后，关闭仪器电源，将对照组放在相同位置相同时间. 培养18 d后对细胞进行四环素荧光标记. 荧光显微镜下观察并采集图像. 钙结节染色 将rMSCs以5×104 cells/mL接种于2个6孔板中，分为对照组与实验组. 接种第2日开始PEMFs作用，对照组处理同前. 28 d后，用茜素红S染液进行钙结节染色. 倒置显微镜下观察