单核细胞趋化蛋白1诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡医学.docVIP

单核细胞趋化蛋白1诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：单核细胞趋化蛋白1诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡医学 1 1材料和方法 2 文2：单核细胞趋化蛋白１在牙髓中的免疫组化研究医学 5 参考文摘引言： 8 原创性声明（模板） 9 文章致谢（模板） 10 正文 单核细胞趋化蛋白1诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡医学 文1：单核细胞趋化蛋白1诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡医学 动脉粥样硬化 (As)与血管内皮细胞（VEC）之间的关系密切，目前被普遍接受的“损伤反应” 学说［1］认为，内皮细胞功能性的损伤是As形成早期的始动环节. 有学者认为内皮细胞的凋亡在As的早期扮演了重要角色［2］. 单核细胞趋化蛋白1（MCP1）是一种趋化激活剂，可以特异地作用于血液中的单核细胞，招引其迁移至内皮下形成泡沫细胞. Selzman等［3］及官秀梅等［4］的研究发现，MCP1不仅有趋化作用，而且可以作为一种生长因子促进血管平滑肌细胞的增殖，从而直接或间接地参与了As的形成，但MCP1对与As发生关系极为密切的内皮细胞的生长有何影响尚少见相关报道，我们对此进行了研究. 1材料和方法 材料 人MCP1（Peprotech公司）；M199培养基，胎牛血清（Gibco公司）；胰蛋白酶，Ⅱ型胶原酶，EDTA（Sigma公司）；Annexin VEGFP 细胞凋亡检测试剂盒，DNA ladder 检测试剂盒（Oncogene公司）；鼠抗人Ⅷ因子抗体、鼠抗人内皮细胞生长因子受体2(KDR)抗体（美国Dako公司）；超净台（苏州苏净集团安泰空气公司）；倒置相差显微镜（日本Nikon公司）；CO2孵箱（美国Thermo Formo公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；凝胶成像系统（英国Syngene公司） 方法 人脐静脉内皮细胞（hUVEC）培养 采用李琴山等［5］改良的酶消化法进行细胞培养，用内皮细胞特异性Ⅷ因子抗体（抗von Willebrand因子抗体）以及KDR mAb免疫细胞化学法鉴定内皮细胞. 本实验所用细胞均为第3代. 实验分组 将细胞分为5组. 阴性对照组：含10 mL/L胎牛血清的M199培养基，2 mmol/L L谷氨酰胺；实验组（M1~M4组）：MCP1含量分别为，，10，100 μg /L. V/PI双染流式细胞仪检测 早期凋亡率将hUVEC以1×106个/瓶接种于50 mL无菌的培养瓶中，孵育24 h后用含10 mL/L胎牛血清的M199同步化12 h后换为不同终浓度的MCP1应用液，24，48 h后用流式细胞仪检测早期凋亡率. 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA ladder将hUVEC以1×106个/瓶接种于50 mL无菌的培养瓶中，孵育24 h后用含10 mL/L胎牛血清的M199同步化12 h后换为不同终浓度的MCP1应用液，24，48 h后按试剂盒说明书提取DNA，15 g/L琼脂糖凝胶电泳. 电压5 V/cm ，电泳 h. 在凝胶成像系统上观察结果并拍照. 统计学处理： 所有数据用SPSS 统计软件进行单因素方差分析及t检验，结果用x±s表示. 2结果 细胞培养与鉴定 培养的细胞在显微镜下观察，细胞呈典型的“铺路石”样结构特征（图1）. Ⅷ因子mAb免疫细胞化学结果显示95%为阳性血管内皮细胞，细胞胞质为棕黄色. GAMFITC绿色荧光显示膜上KDR（AntiVEGF recepter2） 和GARTR红色荧光显示胞内的Ⅷ因子，免疫荧光双标显示95%以上为阳性血管内皮细胞. 证明所培养的细胞为血管内皮细胞，并且纯度符合实验要求. V/PI双染流式细胞仪分析 在 μg/L MCP1作用VEC 24 h即可明显诱导hUVEC的早期凋亡，这种效应随MCP1用量增加和作用时间的延长而明显增强（P，表1）. 表1不同浓度的MCP1作用hUVEC 24，48 h后Annexin V/PI检测早期凋亡（略） 对hUVEC作用 后琼脂糖凝胶电泳在 μg/L的MCP1作用24，48 h时均未见“DNA ladder”，而10 μg/L和100 μg/L的MCP1作用于hUVEC 24，48 h后均可见“DNA ladder”（图2）. 说明MCP1作用于hUVEC可引起凋亡，并且具有剂量依赖性. 3讨论 血管内皮细胞是参与As病理过程的重要细胞，实验证明发生As的局部血管内皮细胞更新加快，提示高频率的内皮细胞凋亡是As发生的第一步［6］，凋亡内皮细胞的增加易改变内皮的完整性和功能，从而诱发As［7-8］. 因此VEC凋亡在As中的作用越来越受到关注. MCP1为一种趋化激活剂，在As斑快中有很高的表达，已证实多种