用线性动力学方法表征L苯丙氨酸对兔小肠黏膜碱性磷酸酶的抑制作用医学.docVIP

用线性动力学方法表征L苯丙氨酸对兔小肠黏膜碱性磷酸酶的抑制作用医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：用线性动力学方法表征L苯丙氨酸对兔小肠黏膜碱性磷酸酶的抑制作用医学 1 1材料和方法 2 文2：用积分法考察黄嘌呤对Candidaspecies尿酸酶的抑制作用 6 1材料和方法 7 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 12 正文 用线性动力学方法表征L苯丙氨酸对兔小肠黏膜碱性磷酸酶的抑制作用医学 文1：用线性动力学方法表征L苯丙氨酸对兔小肠黏膜碱性磷酸酶的抑制作用医学 0引言 反竞争性抑制剂用作临床药物有明显优势［1-2］. 寻找反竞争性抑制剂需测定酶动力学参数（Km和Vm）对抑制剂浓度的响应以确定抑制类型及对应的抑制常数Kiv和Kik ［2-3］. 用双倒数分析法测定动力学参数寻找反竞争性抑制剂时需用从远低于Km到远高于Km范围内的底物浓度. 常规定量方法灵敏度有限，在很低底物浓度下测定初速度可靠性差，这限制了用常规定量方法和双倒数分析法筛选反竞争性抑制剂. 此前发现线性动力学方法只用高于Km的两个底物浓度也能表征竞争性抑制剂［4-5］. 用较高底物浓度有利于用常规方法定量测定初速度. L苯丙氨酸对大鼠小肠黏膜碱性磷酸酶为反竞争性抑制作用［6］. 我们以兔小肠黏膜碱性磷酸酶为模型，考察此线性动力学方法表征L苯丙氨酸对兔小肠黏膜碱性磷酸酶抑制作用的可靠性. 1材料和方法 材料 2amino2methyl1propanol (AMP，美国Fluka公司)；L苯丙氨酸（美国Amresco公司）；对硝基苯酚磷酸酯（美国Sigma公司）；其余为常规国产试剂. 成年大白兔8只，雌雄不拘（本校实验动物中心）. 新茂UV 7504分光光度计. 方法 碱性磷酸酶制备 ［7］将8只大白兔小肠黏膜用250 mL生理盐水制成匀浆， mol/L NaOH调到pH ；四层纱布过滤，4℃下1800 g离心40 min；上清用 mol/L醋酸钠(pH )调至pH 5(出现白色沉淀)，4℃静置过夜再1800 g离心40 min；沉淀用150 mL生理盐水溶解， mmol/L Na2CO3调到pH . 再离心、调到pH 5后收集沉淀，用100 mL冷蒸馏水溶解，冰水浴中缓慢加入40 mL正丁醇，38℃水浴5 min，离心收集下层无色水液约100 mL，搅拌下缓慢加(NH4)2SO4粉末100 g后过夜，离心收集水相和有机相间黏稠状不溶物，用pH 的AMP溶解，离心去沉淀后-10℃保存. 临用前融化后用pH 的AMP缓冲液稀释. 碱性磷酸酶反应 监测缓冲液为100 mmol/L AMPHCl（pH ），其它试剂均用此缓冲液配制. 用 (mmol/L)-1·cm-1的消光系数，据酶完全作用后的产物量标定对硝基苯酚磷酸酯浓度. 酶反应体系总体积 mL，加底物启动反应40 s后，在 min内且底物消耗6％时段的平均速度为初速度. 用 mmol/L底物标定酶活性，换算成酶活性单位数(nkat) 抑制类型和抑制常数确定线性动力学方法 所用低浓度底物(SL)为 mmol/L，高浓度底物(SH)为 mmol/L，酶量为适当稀释的碱性磷酸酶液( μkat/L) 30, 40, 50, 60 μL. 线性回归得两底物浓度下每10 μL酶液的比活性，用相关系数大于的比活性数据计算Km和Vm［4-5］. 用双倒数分析法时所用底物浓度为, , , , mmol/L，适当稀释酶液50 μL. 两种方法所用苯丙氨酸都小于 mmol/L. 据1/Vm和1/Km对抑制剂浓度响应的有效性、两抑制常数比值确定抑制剂类型和对应的抑制常数. 统计学处理：以回归分析有统计学显著意义的数据用于后续分析. 结果用x±s表示，用SAS 8e进行统计分析，t检验比较均值，F检验比较变异系数，χ2检验比较Km和Vm各种变化特征的出现率，P为差异显著. 2结果 双倒数分析法 表征L苯丙氨酸的抑制作用无抑制剂时双倒数分析得兔小肠黏膜碱性磷酸酶Km为(73±7) μmol/L (n=13)；所用苯丙氨酸浓度下Vm变异系数小于10％，优于测定Km的精度. 用双倒数法13次重复测定抑制作用，发现近70％的Km随抑制剂浓度升高而显著降低，其余Km对抑制剂无有效响应；仅1次所得Vm对抑制剂无显著响应，其余Vm随抑制剂浓度升高而显著降低；Km和Vm随抑制剂浓度升高而同步降低者接近70％，Kiv/Kik为(±, n=9)，大于 (t检验，P). 两参数都下降时所得Kiv/Kik都大于但小于，其中小于者约30％，小于者约80％ 线性动力学法表征 L苯丙氨酸的抑制作用相同抑制剂浓度下线性动力学法所得K