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缺氧对大鼠成骨细胞增殖及凋亡的影响 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：缺氧对大鼠成骨细胞增殖及凋亡的影响 2 1 材料与方法 2 11 细胞培养 2 1．11 成骨细胞的原代培养 2 112 培养细胞的鉴定 2 1．2 缺氧条件下培养成骨细胞 3 12．1 缺氧装置的构建[9] 3 12．2 缺氧培养方案 3 1．3 成骨细胞增殖率测定 3 1．4 成骨细胞凋亡的丫啶橙染色 4 1．5 统计学分析 4 2 结果 4 21 成骨细胞的形态观察 4 22 成骨细胞的碱性磷酸酶染色 5 23 矿化结节染色 5 25 面骨细胞凋亡的丫啶橙染色 5 3 讨论 5 文2：溶血卵磷脂对血管内皮细胞增殖及凋亡的影响 7 1 材料和方法 8 2 结果 10 2．2 LPC对HUVECs细胞凋亡的影响 10 3 讨论 11 参考文摘引言： 13 原创性声明（模板） 14 文章致谢（模板） 14 正文 缺氧对大鼠成骨细胞增殖及凋亡的影响 文1：缺氧对大鼠成骨细胞增殖及凋亡的影响 骨折的基本危险因素之一是骨质疏松。最近，动物实验、流行病学和临床研究表明骨质疏松与血管损伤有关[1~5]。有研究[6]指出，骨血流与骨塑形密切相关。研究发现，在股骨颈骨折患者的股骨头上，小动脉或毛细血管的数量显著减少[7]。在末端低血流的妇女中，跟骨的骨量丢失高达大约30%[8]。然而，对于上述发现的准确机制仍不清楚。在血管病理生 理学 中，缺氧是一个重要的因素，它可能会引起成骨细胞生物学行为的变化。因此，本实验通过研究缺氧对成骨细胞增殖及凋亡的影响，旨在探讨缺氧促进骨质疏松形成的作用机制。 1 材料与方法 11 细胞培养 1．11 成骨细胞的原代培养 取新生(出生24 h 以内)Wistar大鼠(兰州大学医学部动物实验中心提供)，将乳鼠放入75%乙醇中消毒，断颈处死，无菌取头盖骨，剔除黏附的结缔组织和血管，将头盖骨切碎，经%胰蛋白酶消化20 min，每3 min 振荡1次，弃去消化液。以0．1%Ⅱ型胶原酶在37 ℃ 消化60 min，每3 min 振荡1次，重复2次，消化液离心1 000 min，10 min；收集细胞，接种于含10%胎牛血清的aMEM培养液中培养，培养瓶置37 ℃ 培养箱，24 h 换液。 112 培养细胞的鉴定 (1)成骨细胞的形态观察。(2)成骨细胞的碱性磷酸酶染色[5]：细胞固定后入基质液(含2 g/L a萘基磷酸钠、2 g/L 坚牢蓝RR盐)，于37 ℃ 孵育15 min，出现紫蓝色斑点后，弃基质液，流水冲洗，乙醇脱水，镜下观察摄像。(3)矿化结节染色：细胞固定后，用0．1%茜素红(alizarin redS)染色30 min，蒸馏水洗3次，乙醇脱水，镜下观察摄像。 1．2 缺氧条件下培养成骨细胞 12．1 缺氧装置的构建[9] 以橡皮塞密封培养瓶口，在橡皮塞上插入两个9#针头分别作为进气、排气孔，高纯氮气通过装有二蒸水的已经高压灭菌处理的大烧瓶过滤后，经胶皮管与进气孔针头相连接，以1 L/min 的流量持续充入5 min，随机从出气孔抽气进行血气分析，控制氧分压为2．5 mmHg(1 mmHg= kPa)，密封。 12．2 缺氧培养方案 取6瓶第2代细胞，分为A，B，C，（通讯刘兴炎教授、博导，E-mail： Gujujun57343@ ）D，E，F 6组。更换无血清培养基，应用上述装置将A，B，C，D，E，F分为常氧组、缺氧1，2，3，4和5 d 组，然后转入常氧培养，根据检测指标决定培养时间。 1．3 成骨细胞增殖率测定 将干预后的细胞用0．25%胰蛋白酶液和0．02%EDTA消化收集细胞，调节细胞浓度为1×104/ml，于96孔板每孔加0．2 ml，同时设空白对照组，只加入培养基。37 ℃ 培养24 h 后，弃取培养液，PBS洗1次，每孔加含10 ml MTT的aMEM培养液，继续培养4 h。弃去培养液，每孔加DMS0 100 ml，震荡，在酶联免疫检测仪上选择570 nm 波长，测每孔的光密度值(OD值) 1．4 成骨细胞凋亡的丫啶橙染色 （1）丫啶橙液的配制： 10 mg丫啶橙溶于100PBS中， pH值4．8~6．0滤过， 4 ℃ 保存。 （2）将干预后的细胞培养满5 d， 吸去培养液， 0．25%胰蛋白酶液消化， 去消化液， 含10%小牛血清的aMEM终止消化， 反复吹打后细胞悬液移入离心管，1 000 min×5 min 离心，加入0．1M PBS液使细胞浓度为107/ml，取95 μl 的丫