基因重组技术生产胰岛素.ppt

一、真核生物表达的优越性和必要性 1、真核生物具有转录后加工系统，可识别并删除基因中的内含子，剪切加工为成熟mRNA 2、具备完善的翻译后加工系统，可进行糖基化、乙酰化等修饰，使蛋白形成正确的天然构型，因而真核生物表达系统产生的蛋白更接近天然状态，有利于其功能、生物活性的研究。 第五十四页，共79页 3、某些真核细胞可将基因表达产物分泌到细胞培养液中，简化了纯化工艺，降低了生产成本。 4、另外，真核生物表达的调控方式非常复杂，有助于我们深入了解基因调控机制。 一、真核生物表达的优越性和必要性 第五十五页，共79页 （一） 外源基因在酵母中表达 （二）植物细胞表达系统 （三）昆虫培养细胞表达系统 （四） 哺乳动物细胞表达系统 二、真核生物表达系统 第五十六页，共79页 （一）外源基因在酵母中表达 １．酵母菌表达外源基因的优势 ２．酵母转化和表达的一般过程 ３．在啤酒酵母中表达的重组蛋白 ４．广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 ５．利用重组酵母生产乙肝疫苗 第五十七页，共79页 1. 酵母菌表达外源基因的优势 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便； 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统； 已经分离出很强的启动子； 能将外源基因表达产物分泌至培养基中； 生长迅速、大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉； 不含有特异性的病毒、不产内毒素,美国FDA认定为安全的基因工程受体系统。 第五十八页，共79页 酵　母 原生质体 感受态 酶去壁 CaCl2 PEG 整合到染色体上 或独立在酵母细胞内 转化 Ura3+营养缺陷型 培养基筛选 转化子克隆生长 带有目的基因的重组载体 鉴定克隆 发酵表达 外源基因产物 分离、纯化 2. 酵母转化和表达的一般过程 第五十九页，共79页 将目的基因克隆至载体 1. 基因及载体分别用限制酶切割； 2. 回收切割的基因和载体，然后用T4 DNA连接酶连接； 3. 将构建的重组质粒转化至大肠杆菌受体菌； 4. 提取重组质粒DNA，酶切鉴定重组质粒，筛选出阳性重组菌株。 第六十页，共79页 HIV-1抗原 丙肝病毒蛋白 诊断试剂 HIV-1外壳蛋白 疟原虫环子孢子蛋白 乙肝病毒表面抗原 疫苗 名称 种类 凝血因子VIIIa ?1抗胰蛋白酶 集落刺激因子 成纤维细胞生长因子 胰岛素前体 血小板源生长因子 类胰岛素生长因子 胰岛素 上皮生长因子 人类治疗用蛋白药物 3. 在啤酒酵母中表达的重组蛋白 第六十一页，共79页 4. 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 酵母属 如酿酒酵母 克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母 毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母 裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母 汉逊酵母属 如多态汉逊酵母 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，　　　　 但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。 第六十二页，共79页 5. 利用重组酵母生产乙肝疫苗 （1）乙型肝炎病毒的结构 　　蛋白包裹的双链DNA病毒，具有感染力的病毒颗粒呈球面状，直径为42 nm，基因组仅为3.2 kb。病毒颗粒的主要结构蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽。颗粒内的蛋白成份包括核心抗原（ HBcAg ）、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。 第六十三页，共79页 （1）乙型肝炎病毒的结构 　　除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成并释放大量的22nm的空壳亚病毒颗粒，其免疫原性是未装配的各种包装蛋白组份的1000倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：S、M、L多肽。 5. 利用重组酵母生产乙肝疫苗 第六十四页，共79页 （2）乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因 5. 利用重组酵母生产乙肝疫苗 第六十五页，共79页 乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。 （3）传统乙肝疫苗的制备 5. 利用重组酵母生产乙肝疫苗 第六十六页，共79页 （4）产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 20世纪80年代开始选择酿酒酵母表达重组HBsAg，将S多肽的编码置于ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平均颗粒直径为 22 nm，其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中的病毒颗粒相同。 5. 利用重组酵母生产乙肝疫苗 第六十七页，共79页 目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAg颗粒已作为乙肝疫苗商品化，重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的1%~2%。进一步的研究表明，M多肽和L多