基因诊断与基因治疗.ppt

* * PCR-SSCP基本过程 ①PCR扩增靶DNA； ②将特异的PCR扩增产物变性后快速复性； ③将单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳； ④通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。 第五十四页，共109页 * * 7、基因芯片 （生物集成模片、DNA阵列、或寡核苷酸微芯片） 基本原理： 指将大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测根据杂交分子和未杂交分子信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。 第五十五页，共109页 * * 基因芯片技术： 第五十六页，共109页 * * 目的：检测外源性基因的侵入 目标： 1、微生物 2、病毒 如： HIV（致艾滋病 AIDS） 3、寄生虫、 4、不易体外培养的病原体（毒性大肠杆菌、麻风分枝 杆菌） 5、实验室培养的病原体（克立氏体） 四、基因诊断的 临床应用: 1、在感染性疾病检测中应用 第五十七页，共109页 * * 艾滋病与HIV病毒 艾滋病由HIV通过接触、血液、血制品及母婴传播感染所致。HIV特异地侵犯辅助性T细胞（CD4），引起人体细胞免疫严重缺陷，导致顽固的机会性感染，恶性肿瘤和神经系统损伤。 HIV 感染后，95%感染者5个月可检出抗体（也有3-4年仍不能检出抗体）。有必要进行PCR技术检测。 第五十八页，共109页 * * 艾滋病与HIV病毒 检测技术：巢式-PCR、Southern、DNA序列分析 引物的设计：应在保守区（基因：pol, env, gag, tat) 病毒特点： HIV病毒由两条单链RNA组成，9.7k / RNA， 主要基因结构和组成形式与其他逆转录病毒相同，但较 之复杂，故称复杂反转录病毒 HIV属反转录病毒－－－即单链RNA反转录成双链DNA， 进入宿主细胞染色体。 第五十九页，共109页 * * 非典型性肺炎（SARS） 由一种新型冠状病毒（SARS-CoV）引起，多种 途径传播，传染性强、高致死率的急性疾病。 诊断依靠： 流行病学、临床表现、放射诊断、 血清学（荧光免疫、ELISA） PCR作为一种灵敏的早期病原学诊断必不可少 （关键是引物的合成） 第六十页，共109页 * * 2、在遗传病检测中的应用 产前诊断 检测妊娠8－12周的绒毛DNA或羊水细胞 PCR诊断一系列遗传疾病 镰刀状细胞贫血的诊断 方法：－RFLP诊断 MstⅡ酶切识别序列：CCTNAGG 切割正常β链序列：CCTGAGG 不切割突变序列：CCTGTGG －ASO探针诊断 第六十一页，共109页 * * 3、在肿瘤检测中的应用 原癌基因 生物正常细胞基因中编码关键性调控蛋白的癌基因 抑癌基因 一类抑制细胞增殖的基因，其失活可引起细胞转化。 两类基因协同调控，使细胞生长处于平衡状态。 第六十二页，共109页 * * 癌基因激活变化及检测： 1、基因扩增：即染色体某区段基因拷贝数增加，或癌基 因的扩增。 检测方法： Southern 杂交 定量PCR 2、基因的过量表达：包括基因扩增基础上的过量表达及非 DNA水平的过量表达。 检测方法： Northern 杂交 RT-PCR 3、点突变： 检测方法为各种基于PCR的方法。 第六十三页，共109页 * * 抑癌基因的检测：Southern PCR 大片段的缺失和点突变 *两个等位抑癌基因突变才能引起肿瘤，需检 出两个等位抑癌基因。 方法：RFLP结合PCR，进行缺失检测 点突变主要采用PCR 第六十四页，共109页 * * 肿瘤标志物：指特征性存在于恶性肿瘤或由恶性肿瘤细 胞异常产生的物质或宿主对肿瘤反应而产 生的物质。 （1）酶类肿瘤标志物 （2）激素类标志物 （3）胚胎抗原 （4）特殊蛋白标志物 （5）糖蛋白类抗原 （6）血中癌基因蛋白 （7）唾液酸和唾液酸酰基转移酶 （8）多胺 免疫组化筛选提高检出率 第六十五页，共109页 * * 法医学鉴定 针对人类DNA 遗传差异进行的个体识别和亲子鉴定。 常用技术: DNA指纹分析（VNTR） 短串