三氧化二砷对人结肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性及其催化亚单位表达的影响临床医学.docVIP

三氧化二砷对人结肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性及其催化亚单位表达的影响临床医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：三氧化二砷对人结肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性及其催化亚单位表达的影响临床医学 1 1 材料与方法 2 2 结果 4 3 讨论 5 文2：三氧化二砷对人大肠癌细胞生长及其端粒酶活性的影响 6 0 引言 6 1 材料和方法 6 2 结果 8 3 讨论 10 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 13 正文 三氧化二砷对人结肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性及其催化亚单位表达的影响临床医学 文1：三氧化二砷对人结肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性及其催化亚单位表达的影响临床医学 三氧化二砷（As 2 O 3 ）注射液 治疗 急性早幼粒细胞白血病已取得肯定疗效。实体瘤体外实验表明，As 2 O 3 对肝癌、肠癌等多种肿瘤细胞有抑制作用［1，2］ ，并有临床报道As 2 O 3 治疗肝癌取得一定疗效［3］。本研究通过动物实验观察As 2 O 3 对人结肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性及其催化亚单位人端粒逆转录酶（human telomerase revee tracriptases，hTERT）表达的影响，进一步探讨As 2 O 3 的抗肿瘤机制，为临床应用As 2 O 3 注射液治疗结肠癌提供实验依据。 1 材料与方法 实验动物 实验动物为裸小鼠，3～5周龄，雄性，体重18～22g，购自 中国 科学 院上海实验动物中心［许可证号SCXK（沪）］，饲养于SPF动物房。 药物及试剂 %As 2 O 3 注射液系哈尔滨伊达药业有限公司产品（国药准字H）;注射液系天津金耀氨基酸有限公司产品（国药准字H）。Tripur-eRNA提取试剂盒购自德国ROCHE公司;TAKARA一步法反应试剂盒购自大连宝森公司;银染.端粒重复扩增（TRAP）试剂自配（TaqDNA聚合酶、dNTP购于Promega公司，CHAPS、PMSF、EGTA购于Sigma公司，其他均为国产分析纯） 移植瘤模型制备及分组 人未分化结肠腺癌细胞株LoVo培养于含10%小牛血清的1640培养液中，在37℃、CO 2 体积分数为的条件下培养，细胞呈单层贴壁生长，每2～3d传代1次。收集并调整细胞数为1×10 7 ml -1 。在无菌条件下裸小鼠右前肢背部皮下注射2×10 6 （） -1 的LoVo细胞，注射局部出现明显皮丘，4～6d后出现结节，移植瘤模型建立。40只裸小鼠均被制成LoVo细胞移植瘤模型，然后随机分生理盐水组、As 2 O 3 低剂量（#12539;kg -1 ）组、As 2 O 3 高剂量（5mg#12539;kg -1 ）组及（20mg#12539;kg -1 ）组4组，每组10只。 用药及处理 所有裸小鼠均于接种后第7天开始腹腔注射给药，按各组所定浓度，每次，1次#12539;d -1 ，连续用药14d，停药次日处死裸鼠，解剖剥离肿瘤，取瘤组织约60mg用PBS缓冲液洗净血液后置-20℃储存，待检测端粒酶活性。 端粒酶活性检测（银染.TRAP法） （1）端粒酶引物:Ts引物序列为5′.AATCCGT ′，Cx引物序列为5′.CCCTTACCCT ′，以上引物由上海SANGON公司合成。（2）细胞提取物制备:取手术标本60mg左右，加100μl细胞裂解液，冰浴30min，16000r#12539;min -1 离心30min，取上清液，-20℃备用。（3）TRAP反应:取1μl细胞提取液，加入TRAP反应液（含1mg#12539;L -1 Ts引物，2UTaqDNA聚合酶，5mmol#12539;L -1 dNTP）。反应体积50μl，30℃保温30min。（4）PCR扩增:加Cx引物（#12539;ml -1 ）1μl进行PCR扩增，94℃30s，54℃30s，72℃30s，35个循环。（5）聚丙烯酰胺凝胶电泳:取扩增产物25μl，在12%的聚丙烯酰胺凝胶中垂直电泳（150～200V，2h），电泳结束后取下凝胶进行银染色。 检测 （1）hTERT引物:上游，5′.CGGAAGAGTGTCTG ′;下游，5′.′。GAPDH引物:上游，5′.′;下游，5′.′。以上引物均由上海SANGON公司合成。（2）检测:采用ROCHE公司的Tripure试剂盒，按操作程序操作，提取总RNA，采用TAKARA一步法逆转录试剂盒进行PCR扩增，产物以2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察成像。阳性标本在235bp处出现明显条带。 2 结果 As 2 O 3 抑瘤作用 用药结束后测定肿瘤结节的长（a）、宽（b）、高（c），按公式 计算 肿瘤体积（ ）=π，结果见表1