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雄性大鼠肺组织中雌激素受体的研究 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：雄性大鼠肺组织中雌激素受体的研究 1 1 材料和方法 1 2 结 果 3 3 讨 论 4 文2：脑内雌激素受体的研究进展 5 GPR30 7 参考文摘引言： 9 原创性声明（模板） 10 文章致谢（模板） 10 正文 雄性大鼠肺组织中雌激素受体的研究 文1：雄性大鼠肺组织中雌激素受体的研究 雌激素（estrogen，E）在人体中有重要作用，它主要通过与雌激素受体（estrogen receptor，ER）结合而发挥生物学作用。本研究旨在探讨ER在雄性大鼠肺组织中的表达和定位。 1 材料和方法 材料 雄性SD大鼠由东南大学医学院动物实验中心提供，平均体重（±）g，日龄70d左右。RNA提取试剂Tripure为Roche Applied Science公司产品，Ac-cess System试剂盒为Promega公司产品，兔抗大鼠ER.β抗体为Santa Cruz公司产品，Vltra Seitive 超敏试剂盒和DAB显色试剂盒为福州迈新生物技术开发有限公司产品。 方法 标本制备 大鼠经戊巴比妥钠（30mg#12539;kg-1 ）腹腔注射麻醉后，取右肺中上叶直接用铝箔纸包裹后先放置在液态氮罐中，后置于-70℃冰箱。标本经10%中性福尔马林溶液固定后，严格于垂直位石蜡包埋;垂直于支气管细支气管断面，矢状位取材，沿肺门横断取材，连续切片，切片厚度5μm，行免疫组织化学染色。 （1）细胞总RNA的提取:用微量天平称取100～200mg肺组织，用2ml玻璃匀浆器在冰浴下制成肺组织匀浆，加入1ml Tripure试剂。按试剂说明书提取细胞内总RNA，紫外分光光度仪（型，日本HITACHI产品）测定其浓度和纯度，重复测定3次， 计算 样本总RNA浓度:A260 .A280 值在～之间。（2）引物的设计与合成:扩增大鼠ER.α、ER.β和β.actin依据Kuiper等［1］ 报道的引物序列由上海申友生物技术有限公司人工合成。ER.α扩增产物长度344bp。ER.α引物:上游引物5′.AAT TCT GAC AAT CGA CGC ′，下游引物5′.GTG CTT CAA CATTCT CCC TCC ′，ER.β扩增产物长度262bp。ER.β引物:上游引物5′.TTC CCG GCA GCA CCA GTA ′，下游引物5′.TTC CCG GCA GCA CCA GTA ′，β.actin扩增产物长度422bp。β.actin:上游引物5′.GAG ACC TCA ACA CCC CAG ′，下游引物5′.TCG GGG CAT CGG AAC CGC ′。（3）RNA完整性的鉴定:变性甲醛凝胶电泳，显示28S、18S及5S三条带，且RNA28S∶18S为2∶1。（4）和凝胶成像分析:按照一步法试剂盒说明书进行RT和PCR扩增。设立β.actin阳性对照作基因转录的对照。取产物5μl在%琼脂糖凝胶上电泳分离，应用凝胶成像系统（GeneQuant，美国Pharmacia Biotech）照相。 免疫组织化学染色 切片经3%H2 O2 孵育15min后置于柠檬酸钠缓冲液（CBS，#12539;L-1 ，pH6）中，微波（850W）修复抗原至沸腾即止，待缓冲液 自然 冷却后取出切片，依次滴加A液（过氧化物酶阻断剂）孵育10min、B液（正常羊血清）孵育10min、兔抗大鼠ER.β多克隆抗体（，Santa Cruz，1∶100）4℃孵育过夜、C液（生物素标记的羊抗鼠IgG）孵育10min、D液（链霉菌抗生物素蛋白.过氧化物酶溶液）孵育10min，以上各步骤之间用PBS洗，DAB显色，苏木素复染，常规脱水透明，中性树胶封片。各组切片同时分别用PBS、正常羊血清代替一抗，以上述步骤处理同样切片作为空白对照和替代对照试验。 2 结 果 结果显示，在大鼠肺组织中ER以ER.βmRNA的表达为主，ER.αmRNA几乎不表达（图1）。免疫组织化学检测结果显示ER.β阳性反应可见于柱状上皮细胞、平滑肌细胞和间质细胞上，血管壁上内皮细胞和平滑肌细胞中也有表达，呈棕黄色，主要定位于细胞核（图2），对照组切片染色结果为阴性，细胞核为苏木素蓝染。 3 讨 论 本试验利用法发现在肺组织中存在ER.βmRNA，而ER.αmRNA几乎不表达。并且免疫组织化学检测结果显示，ER.β阳性反应可见于柱状上皮细胞、平滑肌细胞和间质细胞上，在肺血管壁上，内皮细胞和平滑肌细胞中也有表达，以内皮细胞为多，呈棕黄色，主要定位于细胞核。 E是一类有广泛生物活性的甾体激素，它主要通过与ER结合而发挥生物学作用。ER是一种