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PCR-单链构象多态性 (PCR-single-strand conformation polymorphism，SSCP) ; 单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由 其内部碱基配对、氢键等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或 少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常 敏锐地将构象上有差异的分子分离开。该方法即为单链构象多态性 (Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析。; 将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，建立PCR-SSCP技术。 基本过程： ①PCR扩增靶DNA; ②将特异的PCR扩增 产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子； ③将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳; ④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。 若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。 ;2.制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)  （1）电泳槽玻璃板的处理：用洗涤剂清洗玻璃板，自来水反复冲净洗涤剂，双蒸水冲洗，95％乙醇擦拭，通风橱自然晾干。两块玻璃对齐，底部和两侧用橡胶条封好，用1%琼脂糖胶封底，固定在垂直电泳槽上。 （2） 制胶：按照被分离DNA片段的大小、含量及玻璃板、衬条的大小决定凝胶的浓度与体积，一般来讲使用5％～8％的凝胶较为合适。 ; 在小于1Kb长度的情况下，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下: ;;; （3）按上表配制合适浓度的胶液，轻轻摇匀。用1ml移液器吸取胶液，缓慢注入两玻璃板间的空隙中，直至灌满模具顶部，立即插入相应的点样梳，（小心勿使梳齿下带进气泡，并且不要将梳齿全部插入胶内，留约2mm梳齿于玻璃板上端，以免拔梳时把胶孔拔断）。由于凝胶在聚合过程中有回缩，所以应小心添加些胶液于梳子处，水平放置，室温聚合1hr。小心取出点样梳，在电泳槽内灌入 1×TBE电泳缓冲液，用槽内的缓冲液反复冲洗点样孔，以去除可能存在的??聚合的聚丙烯酸胺和气泡。样品上胶前预电泳约30分钟。; 3.扩增产物的处理：取0.4-1.2μlPCR扩增产物，加入15μl 2×上样缓冲液中，混匀。100oC变性10min，立即冰浴骤冷2分钟以上。然后将10μl混合物上样，以微量加样器上样。上样时要注意不要有气泡冲散样品，而且速度要快，时间长了样品易于扩散。 ; 4.电泳：根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大小，决定电泳的电压及电泳时间。通常室温下以l～5V／cm电泳。 5.剥胶：电泳结束后，回收电泳缓冲液，取下电泳胶玻璃，用塑料楔子从玻璃板底部一角小心分开玻璃，凝胶应附着在一块玻璃上，切去凝胶左上角，作为点样顺序标记。 ;6.银染法 ;步骤：;;SSCP结果; 对出现异常泳动条带的样品，从PCR扩增到SSCP，均重复3次，获相同结果，再送测序确证，以排除PCR反应中的错配或电泳条件差异引起的偶然现象，既使结果可靠，又避免不必要的测序。 ; 1.DNA片段的大小和组成:用于SSCP分析的DNA片段越小，检测的敏感性越高。﹤200 bp的DNA片段检出率为90%，200～500 bp的DNA片段检出率为70～80%，而﹥500 bp的DNA片段检出率﹤50%。对于大于400bp的PCR产物就需要设法进一步处理，可以用限制性酶消化PCR产物，产生小于400bP的DNA片段，再进行SSCP分析。另一方面，核酸片段中碱基的组成以及突变位点临近的核酸序列也可能影响其电泳速度，如富嘌呤序列较富嘧啶序列对碱基变异更敏感。 ; 2.PCR产量和特异性：PCR扩增产物的高度特异性是SSCP成功的前提。首先要优化PCR反应条件，以免非特异扩增带干扰结果分析；其次要避免PCR操作过程的污染。在使用大量PCR产物时，变性的单链DNA会很快地复性，从而影响SSCP检测的敏感性；但如果减少PCR产量，则可能因为单链DNA太少而降低敏感性，所以上样量也要进行摸索。; 3. 游离引物: 游离引物可能同 PCR产物结合而改变其泳动率