分子生物学实验报告借鉴.pdfVIP

分子生物学实验 创新学院生物科学 101 班 韩宝泉 2010014871 本次大试验我们以大肠杆菌、幼嫩的小麦为原料，分别提取了质粒、 DNA 、RNA ，并 以其为主材料进行了诸如 PCR、酶切、 Southern 杂交等实验项目， 取得了较为良好的实验效 果，以下为实验的总流程： 1. 质粒提取：①质粒 1 （GFP ） 转化涂板 培养 Arabine 培养基涂板 GFP 表达观察 ②质粒 2 （P38）主要进行 PCR、酶切、 Southern 杂交三项操作，其中 PCR 包括电泳检测、 探针标记、 Southern 胶点样、T 载体连接 （包括转化、蓝白斑筛选、 菌落 PCR ）。 2.植物 DNA 和 RNA 的提取：① gDNA 提取 Southern 胶点样、 基因组酶切、 基因组 PCR ② RNA 提取 RT cDNA PCR 实验过程 星期一 2012 年 5 月 21 日 一、实验目的 1、 学习碱裂解法提取质粒的原理。 2、 学习质粒酶切和电泳分析。 3、 学习琼脂糖凝胶的制备。 4、 学习 PCR 反应的基本原理和实验技术。 二、实验原理 1、 质粒 DNA 的提取 利用染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件 下，染色体 DNA 的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒 DNA 氢键也大部分断裂，双螺旋 也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当 pH=4.8 的乙酸钠将其 pH 调到中性时，变性的质粒 DNA 又恢复到原来的构型，而染色体 DNA 不能复性，形成缠 绕的致密网状结构， 离心后， 由于浮力密度不同， 染色体 DNA 与大分子 RNA 、蛋白质 -SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。 2、 琼脂糖凝胶电泳 溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光，当 DNA 样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝 胶中的 EB 就插入 DNA 分子中形成荧光络合物；使得 DNA 发射的荧光，增强几十倍。而 荧光的强度正比于 DNA 的含量，如将已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照，就可 比较出待测样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外光下照射拍照，只需 5~10ng DNA ，就可以从照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测到 0.01~0.1ng 的 DNA 。 在凝胶电泳中， DNA 分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。 DNA 分子在琼脂糖凝 胶中泳动时， 有电荷效应与分子筛效应， 前者由分子所带净电荷的多少而定， 后者则主要与 分子大小及构型有关。 DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。在电场中向着正极移 动，在用电泳法检测 DNA 分子时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程 度上降低电荷效应， 使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定， 提高分辨 率。同时适当降低电泳时的电压，也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。 3、 质粒 DNA 酶切 限制性内切酶可以识别双链 DNA 特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末 端，这样有利于 DNA 片段再连接。 限制性内切酶对环状质粒 DNA 有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。因此，鉴定 酶切后的片段在电泳凝胶的区带数， 就可以推断切点的数目